hiv-1整合酶随机突变库的构建

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1、塾亘坠!垫佥堕随扭塞变庄数煎蕉⑧论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人1：壹坠』塾拯』遁直太堂堕塑堡塑堂医评阅人2：隧壑童!塾拯』逝洹太堂垫堂医评阅人3：生送鲨』熬拯』逝洹太堂壅堂医答辩委员会主席：蔓廛主』塾拯』浙江太堂盛堂瞳委员1：痘里国』塾拯』浙江太堂生金型堂堂瞳委员2：隆丛垣』翌窒旦!逝婆笪丝生塑压答辩日期：2013／5／31浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写

2、过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：1t妙鼍影签字溉瑚tj年∥月g日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝婆盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权迸婆本堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位

3、论文作者签名：t必≤席嘭导师签名：签字日期：>DI≥年占月留日签字日期：为B年6月彦日浙江大学硕士学位论文致谢在论文即将完成之际，我首先要感谢我的导师周亚夫(SamsonA．Chow)教授。教授渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在

4、此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢!我要郑重感谢我的第二导师药学院楼宜嘉教授，她严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样，她循循善诱的教导和不拘一格的思路给予了我无尽的启迪。感谢陈爱华、黄佩芳以及沈志成老师在论文编写、提交以及答辩过程中给予的极大帮助。我要诚挚的感谢叶剑老师和陈欢副研究员在我的学习和生活中给予的帮助。你们以渊博的学识、敏锐的洞察力为我指点迷津、帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励，在此表示深深的感谢。感谢杜悦、苏锟楷、王丹、严洁萍、沈国芳、王斌、杨立莉等实验室成员在科研过

5、程中给予我的鼓励和帮助，谢谢你们，你们对我的关心和支持是我不断前进的动力之一，我的研究生生活因为有你们而更加精彩。我要感谢我的父母及家人，你们对我的关爱让我深深感受到了生活的美好，你们是我不断取得进步的永恒动力。最后再一次感谢在我成长过程中关心、帮助过我的老师、同学、朋友们!沈学彬2013年4月于华家池浙江大学硕士学位论文中文摘要研究背景HIV-1整合酶随机突变库的构建浙江大学药学院药理学硕士研究生沈学彬导师SamsonA．Chow(周亚夫)中文摘要整合酶对于HIVol病毒的复制至关重要，同时整合酶在H

6、IV-1生命周期的脱壳与逆转录过程中均发挥了重要作用，使得整合酶成为除蛋白酶、逆转录酶以外的一个非常具有前景的抗HIV治疗的新靶点。目前已有两个经FDA批准的整合酶抑制剂上市，并且同时还有另外一些整合酶抑制剂已进入临床试验阶段。然而，有研究团队发现，一些含有整合酶突变体的病毒株对于正在进行临床实验的或者是已经上市的整合酶抑制剂具有耐受性。化学治疗能够抑制HIV-1病毒的复制以及AIDS的进一步发展，然而在此过程中具有药物耐受性的病毒突变体的出现大大降低了化学治疗的效果，对于治疗来说是一个主要的障碍。新药

7、物的开发，以及对于具有耐受性的病毒基因型数据的分析处理，对于加强治疗效果极其重要。然而，要鉴别出导致药物耐受性的突变需要多年的临床研究。传统的体外实验在获得可靠的耐药性数据方面存在一定的局限性。为了鉴别出具有药物耐受性的整合酶突变体，我们引入了转座子介导的碱基替换突变(transposon—directedbase—exchangemutagenesis，TDEM)的方法。该方法能够制造一个在目的基因上突变位点均匀分布，且每个目的基因的分子含有一至两个氨基酸随机突变的一个突变库。方法我们首先将转座子通过

8、转座反应随机插入到整合酶基因中。转座子的两端具III浙江大学硕士学位论文中文摘要有识别并与转座酶结合的区域以及NotI内切酶识别位点。转座反应完成后，通过NotI内切酶酶切去除转座子并打开转座子所在的位置，露出因NotI酶切而得到的粘性末端，并将同样用NotI酶切得到的突变插入片段(MI)与之进行连接。之后通过BsgI与BpmI两轮酶切，即可去除MI中的多余序列，保留预先设计好的三个连续碱基，这三个碱基便可实现对目的基因中连续三个碱基的替换