利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆-论文.pdf

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1、南通大学学报(医学版JournalofNantongUniversitv(MedicalSciences)2013：33(6·461·利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆孙伟，鲍静p，陆仁飞，杨帆，张娜，朱丹丹，段义农(南通大学医学院病原生物学系，南通226001；南通市第三人民医院检验科；南通大学公共卫生学院)【摘要】目的：体外扩增中国株乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)~因组全长序列，快速构建中国株HBV感染性克隆，建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法：设计保守引物，扩增HBV全

2、长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析，确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR(splicingbyoverlapextensionPCR，SOE—PCR)技术，构建1．3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1．3。将pHBV1．3质粒转染人肝癌细胞系HepG2．采用WesternBlot、酶联免疫吸附试验及Real—PCR检测病毒复制及表达情况检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果：成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组，其GenBank登陆号为KF495606构建了中国株H

3、BV感染性克隆pHBV1-3fC)质粒，该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制，抑制程度依赖于药物浓度。结论：利用SOE—PCR可快速构建HBV感染性克隆．所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制．可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究【关键词】乙型肝炎病毒；C基因型；感染性克隆；复制；表达[中图分类号]R373．2，Q785[文献标志码】A【文章编号]1674—7887(2013)06—0461—06Rapidconstructionofaninfectiousrep

4、liconofhepatitisBvirus(Chinaisolate)viasplicingbyoverlapextensionPCRSUNWei，BA0Jin，LURenfei2，YANGFan，ZHANGNa3，ZHUDandan，DUANYinonf⋯(DepartmentofPathogenBiology，MedicalSchool，NantongUniversity，Nantong226001；ClinicalLaboratory，theThirdPeople’sHospital；SchoolofPublicHe

5、alth，NantongUniversity)【Abstract】Objective：Toclonethefull—lengthgenomeofhepatitisBvirus(HBV)(Chinaisolate)，constructHBVinfectiousreplicon，andconsequentlyestablishcellmodelforHBVreplicationinvitro．Methods：Usingconservedprimers，thefull—lengthgenomeofHBVwasclonedfromc

6、linicalsernmsample．Then，1．3-foldoverlengthgenomeofHBV，fromtheobtainedHBVgenome，wasconstructedbysplicingofoverlapextensionPCR(SOE—PCR)andthenclonedintopBluescriptKs(+)togeneraterecombinantplasmidofpHBV1．3．TherecombinantplasmidsofpHBV1．3werefurthertransfectedintoHepG

7、2cellline．ELISAwereperformedtodetectthelevelsofHBsAgandHBeAginsupernatantofHepG2cells，WesternBlotwasutilizedtorevealthelevelofintracellularHBsAgandHBeAg，andreal—timePCRwasusedtoanalyzethetiterofHBVDNAinsupernatant．AntiviralefectofadefovirwasevaluatedinpHBV1．3(c1tra

8、nsfectedHepG2cells．Results：Thefull—lengthgenomeofHBV(Chinaisolate)wassuccessfullyclonedfromclinicalserumsample，andDNAsequencingresultrevealedthat