脑心肌炎病毒hb10株感染性cdna克隆的构建及其应用

《脑心肌炎病毒hb10株感染性cdna克隆的构建及其应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、密级：论文编号:中囯农业科学院学位论文脑心肌炎病毒HB10株感染性cDNA克隆的构建及其应用ConstructionandApplicationofanEncephalomyocarditisvirus-HBlOInfectiouscDNAClone硕士研宄生：于会彬指导教师：翁长江研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：动物基因工程疫苗培养单位：哈尔滨兽医研究所中国农业科学院研究生院2015年S月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和

2、致谢的地方外，论文中不包含其他人已经i表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宂所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名:时间：年j月:曰关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：+国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内

3、容。研E生签名:时间：年j月7^曰导师签名:时间：少衫产年r月中国农业科学院密级:论文编号:中国农业科学院学位论文脑心肌炎病毒HB10株感染性cDNA克隆的构建及其应用ConstructionandApplicationofanEncephalomyocarditisvirus-HB10InfectiouscDNAClone硕士研究生：于会彬指导教师：翁长江研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：动物基因工程疫苗培养单位：哈尔滨兽医研究所中国农业科学院研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseA

4、cademyofAgriculturalSciencesDissertationConstructionandApplicationofanEncephalomyocarditisVirus-HB10InfectiouscDNACloneM.S.Candidate：YUHui-BinSupervisor：Prof.WENGChang-JiangDegree：MasterofVeterinarianSpecialty:EngineeringAnimalVaccineMay2015摘要猪脑心肌炎病毒（Encephal

5、omyocarditisvirus，EMCV）宿主范围广，可以感染啮齿类动物、猪、大象和非灵长类动物等。有报道称人也可以被感染。EMCV是一个无囊膜的单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，心病毒属。EMCV基因组全长约7.8kb，含一个开放阅读框（openreadingfragment,ORF），ORF的两边为5'和3'UTR（非翻译区）。5'UTR含有一个介导病毒多聚蛋白起始合成的内部核糖体介入位点（internalribosomeentrysite，IRES）和一个poly(C)结构;3'UTR末端含有一个

6、poly(A)尾巴。病毒的基因组编码一个多聚蛋白前体，在3C蛋白酶的参与下裂解为P1，P2，和P3，但是首次裂解发生在蛋白的复制的延伸过程，早于3C蛋白酶的形成，裂解点位于2A和2B蛋白之间，由NPG(P)基序介导。本研究旨在利用反向遗传操作技术建立EMCV-HB10株的cDNA感染性克隆。采用RT-PCR方法，一次性扩增出EMCV-HB10株全长基因组（包括5'和3'UTR）序列，并直接克隆到低拷贝载体pOK12中，构建含有全长EMCVHB10基因组的重组质粒（pEMCV-C9）。该重组质粒经酶切线性化，体外转

7、录为RNA。将转录产物转染BHK-21细胞中进行拯救病毒。转染细胞36h后，出现典型的细胞病变（cellpathogeniceffect，CPE）。拯救病命名为rEMCV-C9并经RT-PCR扩增并全基因组测序鉴定。5'UTR序列比对显示，拯救病毒含有9bp的poly(C)，而亲本病毒的poly(C)结构为C7TCTC3TC10，长度为24bp。该差别可以作为区别亲本病毒EMCV-HB10和拯救病毒rEMCV-C9的一个基因标志。除poly(C)的长度外其余序列均与亲本病毒一致。间接免疫荧光（Indirectim

8、munofluorescenceassay，IFA）和生长曲线试验结果显示，poly(C)长度减少不影响病毒的拯救，拯救病毒与亲本病毒具有相似的生长特性。动物感染试验结果显示，rEMCV-C9的LD504是2×10TCID50，为亲本病毒EMCV-HB10的213倍，以上结果证明poly(C)的长度对病毒在BHK-21细胞上的生物学特性没有显著影响，但是缩短poly(C)