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时间：2019-08-22
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1、重叠PCR—overlapPCR1.简介重叠PCR也是基本的PCR原理：变性-退火-延伸。不同的是在重叠PCR过程是两个或者几个片段重叠延伸之后，再进行指数扩增的PCR过程。2.基本原理第一步：PCR产生两个或者几个片段，这几个片段之间必须有重叠区。第二步：以两个片段为例，见上图，第一步产生的两个片段，AD链之间有互补，BC链之间也有互补，但只有AD链互补重叠延伸产生所需要的重叠片段。第三步：第二步产生的重叠产物，在上下游引物的存在下，即可进行PCR扩增过程。请仔细看清楚原理，特别是第二步。3.实际操作注意点a.第一步PCR之后
2、的产物，可以纯化，也可以吸取几μL作为重叠PCR的模板。b.第二步和第三步一起称为重叠PCR，实际发生过程分为两个步骤。c.Taq酶会在末端加A，高保真酶有3’—5’的外切活性，基于重叠PCR原理和酶的性质，第一步和重叠PCR步骤至少有一步使用高保真酶（或者如TaqPlus、EsTaq之类的，有3’—5’的外切活性），如果第一步和重叠PCR都使用普通Taq可能重叠PCR会失败。d.基于重叠PCR原理，上图中第二步AD链直接的退火很关键，所以有些protocol会建议重叠PCR分两个程序进行也是基于以上原理。重叠区的Tm很关键，或
3、者说退火温度很重要。4.重叠PCR几个应用场景a.片段中间引入突变b.片段中间引入缺失C.片段中间引入插入片段d.片段拼接(如不同结构域DNA片段拼接)e.长片段分段扩增，再重叠PCR拼接。f.从基因组扩增出外显子，再拼接出完整的CDS区。
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