cdh5基因在hoxb4特异性高表达转基因斑马鱼胚胎期造血发育中表达及作用初步的研究

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1、贵阳医学院2012届硕士研究生毕业论文目录摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„19讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„29参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„34英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„40致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„42缩略词表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„43论文原创性声明„„„„„„„„„„„„„„„„„„45附：综述

2、„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„46-1-贵阳医学院2012届硕士研究生毕业论文cdh5基因在HoxB4特异性高表达转基因斑马鱼胚胎期造血发育中的表达及作用的初步研究专业：儿科学研究生：姚冬静导师：何志旭教授摘要目的本实验选择cdh5为目的基因，观察cdh5基因在过表达HoxB4基因的特异性转基因斑马鱼系胚胎期造血发育过程中的表达情况，以探讨cdh5基因与HoxB4基因调控造血发育可能的作用机制。方法收集0.75-120hpf之间多个时相的野生型斑马鱼胚胎，TRIZOL法提取总RNA后，通过RT-PCR扩增cdh52+2+基因片段，将目的片段与载体pCS连接，

3、构建cdh5-pCS重组质粒，以T7RNA聚合酶体外转录制备反义mRNA探针，通过斑马鱼全胚胎原位杂交技术及灰度分析检测cdh5基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况，以及在HoxB4实验组（TG:zLmo2-LDeL-HoxB4-EGFP；TG:zLmo2-Cre）及EGFP对照组（TG:zLmo2-LDeL-EGFP；TG:zLmo2-Cre）斑马鱼胚胎早期发育过程中表达变化2+情况。结果成功构建了cdh5-pCS重组质粒，制备了反义mRNA探针，原位杂交结果示野生型斑马鱼3.7hpf的胚胎即有cdh5基因的阳性杂交信号，而18至36hpf的胚胎cdh5基

4、因在造血组织中间细胞群（ICM）、主动脉-性腺-中肾区（AGM）、后部血岛(PBI)、躯干大血管的血管内皮细胞及脑部组织中表达，30hpf达到高峰，至36hpf明显下降。48至72hpf仅在脑部有少量表达，主要的造血部位未观察到明显的阳性杂交信号。HoxB4实验组、EGFP实验对照组及野生型对照组胚胎中，18-40hpf均可观察到实验组cdh5基因在造血组织中的表达均较对照组明显增多，即过表达HoxB4基因时，cdh5基因的表达也是增加的。44hpf以后cdh5基因在造血组织中的表达差异不明显。结论初步了解cdh5基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况，发现过

5、表达HoxB4的转基因斑马鱼胚胎在造血干细胞增殖明显的情况下，cdh5基因的表达量明显增加，并且这种表达增加只发生在原始及定向造血期，定向造血后其表达逐渐下降至消失，提示cdh5基因可能作为HoxB4的协同或下游靶基因，参与了在HoxB4基因调控的斑马鱼胚胎早期造血干细胞自我修复及增殖分化过程。关键词：造血干细胞斑马鱼原位杂交cdh5HoxB4基金项目：国家自然科学基金面上项目（30960412），贵州省科技基础条件平台项目（[2009]4005），贵州省优秀科技教育人才省长专项资金（S2008-4）-2-贵阳医学院2012届硕士研究生毕业论文前言造血干细胞（Hema

6、topoieticstemcell,HSC）又称多能干细胞，是一群存在于造血组织中的原始造血细胞，具有高度分化以及增殖能力，可以定向分化为红细胞、白细胞、血小板等,是干细胞研究与应用领域中开展较早的，也是迄今为止了解十分深入的一种成体干细胞。造血干细胞的研究起始于20世纪50年代，60年代初获得突破性进展，从此进入了研究造血干细胞的全盛时期。1998年，[1][2]Thomson和Gearhart等人先后成功分离出人胚胎干细胞，并且获得了具有体外无限增殖和多向分化能力的人胚胎干细胞系。造血干细胞被定义为机体内最具独特性的体细胞群，具有高度的自我更新、多向分化、跨系分化

7、与重建长期造血的潜能，以及损伤后再生的能力；除此之外，还具有广泛的迁移和特异性的归巢特[3]性。在造血系统发育中，造血干细胞被认为是处于顶端的源头细胞，因而造血干细胞的体外扩增与定向诱导分化是近年来血液学研究领域的热门课题。目前，造血干细胞工程学的重点与难点是如何既能加快短期造血的恢复、扩增血细胞，又能保留造血干细胞，从而保证长期造血重建，而造血干细胞维持自我更新的机制、调控造血干细胞增殖和分化的因素和机制、如何利用造血干细胞作为靶细胞进行基因治疗等，都有待于发现和研究。转录调控因子HoxB4是Hox同源盒基因家族中的一员在进化过程中高度保[4]+守