irx5b基因在hoxb4转基因斑马鱼胚胎期造血发育中的表达及其相关性的初步研究

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1、《中国图书资料分类法》分类号：R394.3单位代码：10660学号：S090232贵阳医学院2012届硕士学位论文Irx5b基因在HoxB4转基因斑马鱼胚胎期造血发育中的表达及其相关性的初步研究研究生：马健娟导师：何志旭教授年级：2009级专业：儿科学2012年05月22日贵阳医学院2012届硕士研究生论文目录摘要„„„„„„„„„„„„„„2前言„„„„„„„„„„„„„„3材料与方法„„„„„„„„„„„„5结果„„„„„„„„„„„„„„24讨论„„„„„„„„„„„„„„35参考文献„„„„„„„„„„„„„41英文摘要„„„„„„„„„„„„„4

2、5致谢„„„„„„„„„„„„„„47略缩词表„„„„„„„„„„„„„48论文原创性声明„„„„„„„„„„50附：综述„„„„„„„„„„„„511贵阳医学院2012届硕士研究生论文Irx5b基因在HoxB4转基因斑马鱼胚胎期造血发育中的表达及其相关性的初步研究专业名称：儿科学，研究生：马健娟，导师：何志旭教授摘要目的：通过探讨Irx5b基因在野生型斑马鱼及HoxB4高表达转基因斑马鱼中的表达情况，观察其对胚胎期造血发育的影响，从而研究Irx5b基因作为HoxB4可能下游靶基因在斑马鱼胚胎期造血干细胞发育中的功能。2+方法:构建Irx5b-pCS重组质

3、粒,验证其正确性后，制备Irx5b基因反义mRNA探针,通过原位杂交检测Irx5b基因在空白对照组（野生型斑马鱼,Tuebingen）、实验组(HoxB4转基因斑马鱼，zLmo2-LDEL-HoxB4-EGFP×zLmo2-Cre）及实验对照组(EGFP转基因斑马鱼，zLmo2-LDEL-EGFP×zLmo2-Cre）中的表达情况。观察Irx5b基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中表达情况，以及HoxB4基因高表达时对Irx5b基因表达的影响。应用实时荧光定量PCR反应检测Irx5b基因mRNA在实验对照组及实验组中的表达水平。2+结果：成功构建Irx5b

4、-pCS重组质粒，通过原位杂交显示：Irx5b基因在野生型斑马鱼受精后（hourspostfertilized,hpf）12-72均有表达，具体表达情况如下：12hpf的后脑，18hpf的后脑、原肾管及表皮血管网，24hpf的后脑、中脑、原肾管、表皮血管网及后部血岛（posteriorbloodisland，PBI），30-36hpf的后脑、中脑、原肾管、表皮血管网及PBI，48-72hpf后脑、中脑有信号表达。通过比较Irx5b基因在空白对照组、实验对照组及实验组中信号表达发现：24-36hpf时在实验组原肾管及后部血岛的表达均较其他两组明显增强，18、

5、48及72hpf在三个组中信号表达无明显差异。实时荧光定量PCR实验显示：在24、30及36hpf斑马鱼胚胎中实验组Irx5b基因mRNA的表达水平较实验对照组高，并且差异具有统计学意义。结论：在野生型斑马鱼造血系统中Irx5b基因表达量较低，但是高表达HoxB4基因的转基因斑马鱼中，24、30及36hpf的胚胎造血区域Irx5b基因表达增强，结合实时荧光定量PCR实验结果，推测在斑马鱼胚胎造血发育过程中Irx5b基因作为HoxB4可能的下游靶基因共同参与造血干细胞的增殖过程。关键词：斑马鱼造血发育HoxB4Irx5b本研究受：国家自然科学基金面上项目（3

6、0960412），贵州省科技基础条件平台项目（[2009]4005）资助2贵阳医学院2012届硕士研究生论文前言[1]干细胞(stemcells)是具有自我更新能力的(self-renewing)多潜能细胞。造血干细胞(hematopoieticstemcell，HSC)是干细胞的一种，是具有高度自我[2-3]更新能力和多项分化潜能的造血前体细胞，是干细胞中研究最深入及应用最广泛的一种，其被认识和应用已经近50年。成年人血液造血干细胞主要存在于骨髓，约占骨髓细胞的0.05%。其主要功能是通过不断分化产生各系造血祖细胞，终生为造血系统提供新细胞来源。同时它们

7、又能自我更新即自我复制，维持自身数量不变，从而能长期维持机体的正常造血机能。正是因为造血干细胞具有自我更新，高度增生潜能及多向分化的潜能，因此造血干细胞移植（hematopoietic[4]stemcelltransplantation，HSCT）广泛应用于治疗各种血液系统恶性疾病。目前，临床上移植所需的造血干细胞主要有四个来源：骨髓移植（bonemarrowtransplantation，BMT）；外周血造血干细胞移植（peripheralbloodstemcelltransplantation，PBSCT）；脐带血造血干细胞移植（codebloodst

8、emcelltransplantation，CBSCT）；胎儿肝脏