斑马鱼胚胎早期发育中microrna+mir-1的时空表达

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1、文摘：斑马鱼(Daniorerio)产卵量大，形态学和生理学方面和哺乳类有很多相似性，基因组学方面的操作手段已经较为成熟，基于表型的大规模前向遗传学筛选已能够有效方便进行，脊椎动物疾病信号传导路径在物种间高度保守，使其成为近年来广泛使用的生物模型。基于以上这些优势，斑马鱼在人类疾病模型、药物筛选以及发育生物学研究方面显示出巨大的潜力。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的,长度仅为18～25个碱基对，短小的非编码RNA，在植物和动物体中发挥着重要的基因调控作用,它主要以碱基互补配对的特异方式靶向作用于目标基

2、因mRNA,进行切割降解mRNA或者抑制目标基因蛋白翻译。到目前为止，在高等真核生物中已经发现了很多microRNAs(miRNAs)。通过一些功能性的实验证实，这些microRNA在发育时序调控(lin-4)、神经元分化(miR-23)、组织生长(miR-214)、帕金森氏综合症(miR-133b)、细胞凋亡(miR-14)、心肌肥大(miR-133)、癌症(miR-10b)等方面发挥着十分重要的作用。多种生物(如斑马鱼)利用microRNA以组织或者时间特异的方式来调控基因的表达，进而指引发育进程。然而，单个具体

3、的microRNA的功能到目前为止却知之甚少。针对这个问题，我们利用斑马鱼来分析microRNAmiR-1的表达和功能。通过对斑马鱼microRNAmiR-1的表达和功能的综合分析将有助于阐明肌肉发育的机制，有望在将来为人类肌肉相关的疾病治疗提供新的策略。1．利用miRNA整胚原位杂交技术构建斑马鱼microRNAmiR-1的时空表达谱为了进一步探索miR-1在斑马鱼肌肉发育中所起的功能，我们用地高辛标记的锁核甘酸修饰的DNA寡核甘酸探针通过进一步的miRNA整胚原位杂交,构建了miR-1的时空表达谱。结果显示：斑马

4、鱼microRNAmiR-1在发育的极早期(0.75hpf-4hpf)就开始表达；但是从6hpf一直到12hpf，没有检测到miR-1的表达；从24hpf一直到120hpf，microRNAmiR-1主要特异地在斑马鱼的躯干、头部和鳍部位的肌肉表达；对原位杂交之后的72hpf斑马鱼进行冰冻切片，切片也显示：miR-1特异地在斑马鱼体节部位的肌肉表达。2．利用显微注射的方法将锁核苷酸修饰的miR-1反义寡核苷酸导入1～2细胞期的斑马鱼胚胎中以特异性的敲低内源性的斑马鱼miR-1单只胚胎注射0.1pmol的锁核苷酸修饰的

5、miR-1反义寡核苷酸，结果显示：48hpf时，实验组的胚胎出现了明显的围心腔水肿，循环红细胞堆积在血管中，以及体节肌肉缺陷。3．利用生物信息学预测和分析斑马鱼microRNAmiR-1的靶基因利用miRandav1.0b和RNAhybrid生物软件分别进行斑马鱼microRNAmiR-1的靶基因预测以及miR-1的作用位点的生物信息学分析。分析结果表明：Smyd1a、Hspd1和Hsp70可能是斑马鱼miR-1的三个潜在的靶基因。Smyd1a和SmyD1b是由SmyD1基因通过不同的剪切方式生成，它们均属于组蛋白甲

6、基化转移酶，在骨骼肌和心肌收缩方面发挥重要作用。这两个基因均特异地在斑马鱼胚胎的骨骼肌和心肌表达。已有的研究表明，SmyD1a在斑马鱼肌纤维成熟过程中肌原纤维组织装配方面发挥关键作用，Hspd1和Hsp70影响哺乳动物肌细胞凋亡。我们推测，斑马鱼microRNAmiR-1在早期胚胎发育和斑马鱼肌生成方面发挥关键作用；斑马鱼miR-1可能通过作用于不同的靶基因来调控发育进程的不同层面，最终影响肌生成。关键词：斑马鱼miR-1胚胎发育肌生成miRNA整胚原位杂交显微注射生物信息学分析；Absract：Inrecentye

7、ars,theDanioreriohasbecomeawidelyusedmodelorganismbecauseofitsfecundity,itsmorphologicalandphysiologicalsimilaritytomammals,theexistenceofmanygenomictoolsandtheeasewithwhichlarge-scale,phenotype-basedscreenscanbeperformed.Becauseoftheseattributes,thezebrafish(D

8、aniorerio)exhibitagreatpotentialformodellinghumandiseasesandfordrugdiscoveryanddevelopment.MicroRNAs(miRNAs)areendogenous,smallnoncodingRNAsof18～25ntthatplayimportantregulat