cdh5在hoxb4转基因斑马鱼胚胎期造血发育中的表达及对造血发育影响的研究

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1、目录摘要……………………………………2前言……………………………………4材料与方法………………………………7结果……………………………………28讨论……………………………………45参考文献…………………………………49结论……………………………………54英文摘要…………………………………55致谢……………………………………57略缩词表…………………………………58论文原创性声明…………………………59附：综述………………………………60贵阳医学院2013届硕士研究生毕业论文Cdh5在hoxb4转基因斑马鱼胚胎期造血发育中的表达及对造血发育影响的研究专业：免疫学研究生：吴西军导师：何志旭教

2、授摘要目的同源盒基因hoxb4在促进造血发育方面有重要作用，本课题组前期对hoxb4调控造血发育的机制研究中发现,hoxb4过表达的造血组织rap1的表达是上调的，已有的研究显示在血管的发育中rap1可调控cdh5的表达，这些研究提示cdh5可能是hoxb4的下游靶基因，共同参与了造血发育的调控。本研究欲探讨在hoxb4过表达时cdh5对造血发育的作用,以揭示cdh5参与hoxb4调控造血发育的机制。方法分别收集实验组（TgzLmo2:LDL-Hoxb4-egfp×TgzLmo2:Cre）和对照组（TgzLmo2:LDL-egfp×TgzLmo2:Cre）转基因斑马鱼24hpf、30hp

3、f的胚胎，将其制备为单细胞悬液，用流式细胞仪分选表达绿色荧光蛋白标记的成血成血管共同前体细胞；提取各组标本总RNA，并逆转录成cDNA，用实时荧光定量PCR的方法检测各标本中cdh5基因的mRNA表达量并比较分析其差异。构建带egfp报告基因的cdh5全长表达质粒并测试其能否工作；利用SP6体外转录系统分别获得cdh5和egfp的加帽mRNA，将该mRNA分别显微注射入野生型斑马鱼单细胞期胚胎后，收集3.75hpf、6hpf、9hpf、18hpf、24hpf、30hpf、36hpf、48hpf和72hpf的有绿色荧光蛋白表达的cdh5过表达组、egfp对照组及空白组胚胎，提取各组标本的总

4、RNA，并逆转录制备cDNA，经实时荧光定量PCR检测scl、lmo2、c-myb和runx1的mRNA表达量。结果经实时荧光定量PCR的方法检测后发现：hoxb4实验组cdh5基因mRNA的表达量在24hpf和30hpf均较egfp对照组明显升高，有统计学意义（p﹤0.05）。2+构建了cdh5-egfp-pCS重组质粒，经显微注射有绿色荧光蛋白表达；经sp6体外转录出了cdh5-egfp和egfp的加帽mRNA；两种mRNA经显微注射后均可以观察到绿色荧光的表达。过表达cdh5的胚胎原始造血转录因子scl在6hpf、9hpf、18hpf、24hpf、30hpf，lmo2在3.75hp

5、f、6hpf、9hpf18hpf、24hpf、30hpf时均较egfp组和空白组明显升高，有统计学意义（p﹤0.05）；成体造血转录因子c-myb在3.75hpf、6hpf、9hpf18hpf、24hpf、30hpf，runx16hpf、9hpf18hpf、24hpf、30hpf时均较egfp组和空白组明显升高，有统计学意义（p﹤0.05）。结论hoxb4过表达转基因斑马鱼胚胎期造血组织中cdh5的表达量明显升高。在野生型斑马鱼胚胎中过表达cdh5时可以引起原2贵阳医学院2013届硕士研究生毕业论文始造血增强；早期阶段的成体造血也明显增强。cdh5基因可能是hoxb4基因的下游靶基因，共

6、同参与了胚胎早期阶段hoxb4对造血发育的调控过程。关键词：斑马鱼造血发育hoxb4表达变化cdh5基金编号：本课题受国家自然科学基金课题（30960412）资助3贵阳医学院2013届硕士研究生毕业论文前言造血干细胞（hemapoieticstemcell，HSC）是具有高度的自我更新能力和多向分化[1-3]潜能的造血前体细胞，并且能够在自我更新和多向分化之间保持干细胞池的稳定。自上世纪50年代以来，随着技术的进步，使多年来造血干细胞从抽象的理论推测得到了直接的实验证据，也使得造血干细胞的研究获得突破性进展。成人的造血干细胞主要的生成和储存部位是骨髓，约占骨髓细胞总数的0.05%左右，这

7、群细胞是最具独特性的群体，具有高度的自我更新、多向分化、跨系分化的能力，有重建长期造血的潜能；[4]此外，还具有迁移和归巢特性,因此造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT)成为一些难治性疾病，特别是血液系统恶性疾病的首选治疗方法，这种方法将供者健康的HSC移植给患者重建造血和免疫,取得了满意的效果。而这种移植需要相当数量的细胞，需多次采集，大大增加了风险几率。目前临床应用面