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时间:2018-07-07
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1、斑马鱼几种CYP基因在性腺不同发育阶段表达研究1绪论1.1细胞色素P450研究进展细胞色素P450(CYP450)蛋白酶超家族是一类血红蛋白酶,与其他血红蛋白酶类相同其也以血红素为辅基。其之所以命名为细胞色素P450,是因为还原型细胞色素P450易与一氧化碳结合,且能生成一复合物,这种复合物在450nm处有一吸收峰。细胞色素P450酶系中的酶类主要在内质网、微粒体、线粒体等于物质代谢相关的细胞器膜和质膜分布,其主要以膜结合和可溶性两种形态存在[1]。细胞色素P450酶系的催化作用得以实现,依赖于电子供体NADPH,细胞色素P450酶具有通过2个辅基FAD和FMN从NAD
2、PH转移电子的能力[2]。细胞色素P450酶系所催化的反应可简单表示如下:NADPH+H++O2+RH=NADP++H2O+ROH,其中,R表示底物,如甾体、脂肪酸或带有烯烃、烷烃、芳香环或杂环取代基的化合物,常作为氧化作用的位点[3]。生物体内生物活性小分子的生成、外援物质如药物代谢等都离不开这一反应,因此对于生物体而言该反应具有非常重要的作用。已有研究证明,这一反应为细胞色素P450酶系在体内发挥诸多功能例如烷基的羟化,烯基的环氧化,烃基的氧化等[4]的基础反应。细胞色素P450酶系参与多种反应,其作用底物多种且催化反应种类也多种,这一特点使其成为是很多内源性和外源
3、性物质代谢反应过程中的关键酶系[5]。..1.2斑马鱼细胞色素P450研究进展细胞色素P450超基因家族是一类编码参与一些内源性物质(如激素、胆固醇)和外源性物质(如药物、环境化合物)代谢的酶系的超基因家族[33]。细胞色素P450基因家族是一个成员数目巨大的庞大的家族,该基因超家族约有100个家族,包括600多个成员,广泛存在与动物、植物、微生物的各种组织中。为了好区分数目庞大的细胞色素P450基因以及方便对其进行研究,细胞色素P450基因家族被分为多个家族、亚家族,其分类的主要依据为细胞色素P450基因家编码的蛋白质的氨基序列之间的同源性。氨基酸序列的同源性达到40
4、%以上即可归类为一个家族,氨基酸序列的同源性达到55%以上即可归类为一个亚家族[34]。细胞色素P450基因的表示,以英文字母CYP代表,家族以CYP后的阿拉伯数字代表,而亚家族以阿拉伯数字后的大写字母表示,例如CYP1A等。斑马鱼中共存在94种CYP基因,分布于18个基因家族,而且这些基因家族同样存在于人类和哺乳动物,与人类CYP基因相同,斑马鱼CYP基因按其功能可分为两类:一类是与内分泌相关的基因CYP5-CYP51,另一类为外援物质代谢相关基因,CYP1-CYP3,以及稍相关的CYP4家族[35]。2材料与方法2.1实验材料(1)焦碳酸二乙酯(DEPC),EDTA
5、-Na2,IPTG,X-gal,氨苄青霉素,蛋白酶K,琼脂糖,Tris,蛋白胨,酵母粉,琼脂粉购自大连盈欣化学试剂有限公司;(2)异丙醇,氯仿,乙酸钠,无水乙醇,氢氧化钠,冰乙酸,氯化锰,氯化钙,氯化钠,氯化钾,盐酸,SDS,苦味酸,冰乙酸,甲醛,盐酸,二甲苯,石蜡,甘油,苏木精,伊红,中性树胶等购自大连沈联化学试剂玻璃仪器有限公司。(3)TRizol试剂,pUCM-T载体,DL-2000DNAMarker,SYBRPremixExTaqTMⅡKit(TliRNaseHPlus)均购自TakaRa(大连)公司,DH5α感受态由本实验室保存;(4)TaqDNA
6、聚合酶,PCR回收试剂盒,质粒提取试剂盒,6Loadingbuffer,实验所用引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;(5)M-MLV反转录酶购自天根生化科技(北京)有限公司。.2.2实验方法本实验室,水族箱规格50cm35cm35cm。水族箱及其内部过滤设备等刚买回需用3%高锰酸钾进行浸泡,然后用清水洗净。缸中用水草专用底泥种植水草,水草养殖半月左右,待缸内稳定方可将斑马鱼放入。此外,缸内水为经过曝气的自来水,水流自动循环,水中充氧,缸中置的加热棒,加热棒数目随室温增减,水温控制在25℃左右。亲鱼每天投喂商品饵料(脱壳丰年虾卵),每天投喂3次,投喂时采用少量多次
7、方法投喂,繁殖期间可以适当增加投喂量和投喂次数。亲鱼培育期间,保持水质良好,通过上部过滤器来保持水质的相对稳定。每周换水,换入的水为曝气48小时的自来水。斑马鱼在繁殖受光照周期影响,一般在早上日出后产卵。为促进斑马鱼的成熟,繁殖前注意水族箱上水草灯的开关时间。繁殖期间,可适当增加投喂次数,并且增加鲜活饵料的投喂。繁殖前一晚,按照雌雄3:2的比例选择健康亲鱼,放在孵化器内,用遮光布将水族箱罩住,严格控制卡控制光周期为14:10(光照14h,黑暗10h)。第二天早上,给予斑马鱼光照,将孵化器雌雄鱼之间的隔板打开,雌雄斑马鱼追尾交配,其一般在给
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