半滑舌鳎性别相关基因dazl和wt1a的克隆与表达分析

《半滑舌鳎性别相关基因dazl和wt1a的克隆与表达分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、谨以此论文献给我帮助过我的所有人！---------------张红半滑舌鳎性别相关基因DAZL和WT1a的克隆与表达分析学位论文答辩日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示

2、谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日---------------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子

3、杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日半滑舌鳎性别相关基因DAZL和WT1a的克隆与表达分析半滑舌鳎性别相关基因DAZL和WT1a的克隆与表达分析摘要半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）因具有生长快、口感鲜美、市场价值高等特点，是一种理想的增养殖对象。但是半滑舌鳎雌性的生长速度是雄性的2-3倍，且存在天然的性逆转

4、现象，性逆转后的伪雄鱼繁殖能力差，后代伪雄鱼比例高。因而研究半滑舌鳎的性别决定机制，实现单性育种对于半滑舌鳎养殖业的发展具有重要的经济意义。本文克隆了半滑舌鳎DAZL和WT1a基因，发现它们均是半滑舌鳎性别相关基因。通过研究这两个基因的表达情况，尤其是与性腺分化早期的组织学观察结合起来，不仅有利于阐明DAZL基因和WT1a基因在ZZ/ZW型鱼类的性腺分化中的作用，而且为找出半滑舌鳎性别决定的关键控制基因以及实现全雌育种提供基础材料和理论依据。本文通过组织切片观察半滑舌鳎性腺的分化和发育情况，发现该批仔鱼雌性性腺

5、在46天之前雄鱼性腺分化不明显。56天时，雌性仔鱼性腺开始出现不规则的沟壑，出现卵巢腔，说明性腺开始分化，并且雄性性腺的分化晚于雌性性腺。另外对成鱼的性腺切片观察发现性逆转后的雌鱼性腺中有大量的精子，且与正常雄鱼的性腺切片差异不大。本研究利用RACE技术克隆了半滑舌鳎DAZL基因的全长。通过测序和拼接获得了半滑舌鳎DAZL基因的cDNA序列2026bp，含有636bp的完整开放阅读框（ORF），编码211个氨基酸，编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复序列。荧光定量PCR结果显示，DAZL基因在半滑

6、舌鳎性腺特异表达，并且DAZL基因在雄鱼中的表达量显著高于雌鱼和伪雄鱼，但在雌鱼和伪雄鱼性腺中表达量差异不大，说明DAZL基因并不是性逆转的标志性基因，在生理性别为雄性的伪雄鱼性腺中仍然保持正常雌鱼的表达模式。在胚胎发育各时期的表达结果显示，DAZL基因在受精后20h（神经胚期）之前表达量较高，并在20h达到最高值，而20h以后表达迅速降低，可能是20h以后原始生殖细胞的形成导致。在仔鱼发育各时期的表达结果显示，DAZL在仔鱼发育25d至65d表达量呈上升趋势，并且在雌鱼46d时出现显著升高，在雄鱼56d时出现

7、显著升高，与仔鱼的性腺的分化时期相吻合。这些结果说明，DAZL基因是半滑舌鳎性别特异基因，I半滑舌鳎性别相关基因DAZL和WT1a的克隆与表达分析但并没有参与性反转的过程，并且可能在半滑舌鳎性腺的分化过程中起重要作用。本文从半滑舌鳎全基因组序列中获得WT1a的部分序列，然后利用同样的方法克隆了WT1a基因的全长。克隆结果显示：WT1a基因全长cDNA为1886bp，开放阅读框（ORF）长为1470bp，编码490个氨基酸，并且包含KTS三肽，5’UTR和3’UTR分别长为245bp和171bp。在ORF末端发现

8、2个微卫星（SSR）序列和2个跨膜螺旋区域，而在其他物种中未发现该序列，经验证该序列在半滑舌鳎中普遍存在，这可能是半滑舌鳎所特有的。氨基酸序列分析显示WT1a基因的保守性很高，与人的同源性也高达90%。荧光实时定量分析结果显示：WT1a在雌鱼和雄鱼性腺中表达显著高于其它各组织，并且在雄鱼性腺中的表达显著高于雌鱼，在雌鱼性腺中的表达又显著高于伪雄鱼，说明该基因是性别相关基因。在胚胎发育各