半滑舌鳎amh基因的克隆及表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M090107272上海海洋大学硕士学位论文题目：半滑舌鳎AMH基因的克隆及表达分析Anti-mullerianhormonegeneofthehalf-smooth英文题目：tongue-sole（Cynoglossussemilaevis）:cloninganditsmRNAexpression专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：分子遗传育种姓名：刘姗姗指导教师：陈松林二O一二年四月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工

2、作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适

3、用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）AMH基因的克隆及表达分析摘要鱼类性别相关基因的克隆与表达以及性别决定分子机制的研究是鱼类养殖业发展的需求，也是目前国际上急待攻克的重要科学问题。半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）为我国特有经济海水鱼类，市场价值极高，同时它也是目前发现的雌雄生长差异最大的鱼类之一。半滑舌鳎又是一种存在天然性逆转现象的雌雄异体鱼类，且性别决定类型为ZW型。半滑舌鳎所具有的这些

4、特点使其成为研究鱼类性别决定机制、筛选性别（特别是雌性）特异/决定基因，研究鱼类性别分化和调控机制的理想材料和模型。抗缪勒氏管激素（anti-Müllerianhormone，AMH）也叫缪勒氏管抑制物（Müllerianinhibitingsubstance，MIS)是以多肽形式存在的细胞因子，属于转化生长因子β（TGF-β）超家族中的一员，广泛分布于脊椎动物和无脊椎动物中。AMH基因在雄性性腺分化期抑制缪勒氏管的形成，阻止雌性生殖器官的发育，而使中肾管发育成雄性生殖器官，是性别分化中的一个重要因子。自1986年Cate等首次从人类中克隆出

5、该基因以来，一直受到极大关注。抗缪勒氏管激素基因拥有TGF-β超家族共有的标志性结构，即具有AMH-N区域及TGF-β结构域，并且还含有该家族典型的9个保守的半胱氨酸残基。本文以半滑舌鳎为研究对象，成功的获得完整的AMH基因开放阅读框（Openreadingframe,ORF）、基因组及启动子序列。滑舌鳎AMH基因的开放阅读框（ORF）长为1563bp，编码520个氨基酸（不包括终止密码子），拥有TGF-β超家族共有的标志性结构。扩增得到的基因组序列大小为2855bp，通过与开放阅读框cDNA序列比对，发现半滑舌鳎AMH基因含有7个外显子和6

6、个内含子，与奥里亚罗非鱼和斑马鱼的AMH结构相似。进化树分析表明，与牙鲆（Paralichthysolivaceus）相似性最高为61.7%，其次为花鲈（Lateolabraxjaponicus）58.7%、舌齿鲈（Dicentrarchuslabrax）57.1%。半滑舌鳎AMH启动子的克隆及转录结合位点的分析发现，半滑舌鳎AMH基因的启动子区域含有TATA框，并存在SRY、GATA-1、Sox5等结合位点。I上海海洋大学硕士学位论文应用实时定量PCR（real-timePCR）方法检测发现，半滑舌鳎AMH基因在精巢组织中高表达，而在卵巢组

7、织中表达较低；AMH基因在孵化后70d表达最高，说明其可能在半滑舌鳎性别分化中起一定作用。AMH基因在八月龄的半滑舌鳎精巢中表达很低，说明在精原细胞的形成期可能抑制了其表达。AMH基因在性逆转的伪雄鱼性腺中表达也很高，表明AMH在半滑舌鳎性腺发育和性逆转过程中都可能起到一定作用。应用RNA反义探针原位杂交，对AMH基因在半滑舌鳎性腺中的表达进行了检测发现，在卵巢中，AMHmRNA在颗粒细胞中表达，但在日本鳗鲡和青鱂卵巢中并未检测到AMH的表达，与斑马鱼的表达模式一致；在精巢中，AMHmRNA在支持细胞中表达，这与许多硬骨鱼类的表达模式一致。以

8、上说明，AMH基因在不同物种中可能发挥不同的作用。总之，半滑舌鳎作为我国重要养殖经济鱼类，AMH基因的克隆及表达分析为将来半滑舌鳎性别控制及单性育种提供了基础材料。