半滑舌鳎lgr8基因克隆和csw3基因的功能验证

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1、学校代码：10264研究生学号：M120107161上海海洋大学硕士学位论文题目：半滑舌鳎LGR8基因克隆和CSW3基因的功能验证MolecularCloningandExpressionAnalysisofLGR8and英文题目：CSW3FunctionVerificationintheHalf-smoothTongue-sole,Cynoglossussemilaevis专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：半滑舌鳎性别相关基因研究姓名：吴娅红指导教师：陈松林研究员二O一五年四月六日曰VlCZ/:八，:.，：上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称

2、备注中国海洋大学教授主席中国海洋大学教授委员中国海洋大学教授委员法I中科院海洋所研究员委员)中科院海洋所研宂员委员中国水产科学研宄院副研究员秘书黄海水产研宄所答辩地点黄海水产研究所答辩日期2015.6.5半滑舌鳎LGR8基因克隆和CSW3基因的功能验证半滑舌鳎LGR8基因克隆和CSW3基因的功能验证摘要LGR8是胰岛素样因子3(INSL-3)在体内的特异性受体，属于G蛋白偶联受体(GPCR)大家族。哺乳动物中LGR8高表达于睾丸引带等组织；在人类研究中发现编码LGR8和INSL-3的两个基因分别控制着哺乳动物雄性器官下降所必需的腹股沟韧带和索状引带的分化发育。目前一

3、般认为，LGR8或INSL-3的突变有可能导致隐睾症的发生。本实验在对半滑舌鳎全基因组测序与转录组测序的基础上，通过RACE的方法克隆得到了半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)LGR8基因全长，该基因全长为2768bp,共编码734个氨基酸。对其进行实时荧光定量PCR结果显示，在成熟性腺中，LGR8在雄性中主要在脑、性腺中表达；在雌鱼体内各组织中表达无显著差异，且雄鱼性腺和脑中的表达量要显著高于雌鱼；通过对不同时期的性腺进行实时荧光定量PCR结果显示，LGR8基因在鱼体发育80天左右表达量开始上升，150d~210d表达量达到最大，这表明LGR8在

4、半滑舌鳎性别决定和性腺发育中起到一定的作用。CSW3是本实验室在对半滑舌鳎基因组测序与转录组测序的基础上克隆得到的半滑舌鳎特有且在雌性性腺中高表达的基因，我们通过RACE技术克隆得到了半滑舌鳎CSW3基因cDNA全长。CSW3cDNA基因全长为1714bp，其中5端非翻译区长173bp，3端非翻译区长929bp，编码区为612bp，编码共204个氨基酸。通过定量PCR实验结果表明，CSW3基因为组织广谱性表达，且在卵巢中表达最高。实验通过分析CSW3重组蛋白注射性腺后Dmrt1、Sox9、Amh、P450等性别决定相关基因的表达调控，探讨CSW3在半滑舌鳎性别决定与

5、分化中的作用。重组蛋白注射半滑舌鳎性腺后实时定量PCR分析结果显示，Dmrt1、Sox9、Amh、P450等基因的表达量有不同程度的上调和下调，证明了CSW3蛋白具有一定的活性，可能一定程度上在性别决定中发挥重要作用。关键词：半滑舌鳎，CSW3，蛋白注射，LGR8基因III半滑舌鳎LGR8基因克隆和CSW3基因的功能验证MolecularCloningandExpressionAnalysisofLGR8andCSW3FunctionVerificationintheHalf-smoothTongue-sole,CynoglossussemilaevisABSTRA

6、CTThisexperimentinhalfsmoothtonguesoleonthebasisofthesequencingofentiregenomeandtranscriptome,weclonedLGR8geneusingtheRACEmethod.Thefull-lengthofLGR8is2768bp,whichencoding734aminoacids.ThefluorescencequantitativePCRresultsshowedLGR8mainlyexpressedinmalefishinbrainsandtestises,andtherei

7、snosignificantdifferenceamongthedifferenttissuesoffemales.Moreover,theexpressionquantityinmalesissignificantlyhigherthanthatoffemales;Basedonthedifferentperiodsofgonads,real-timefluorescentquantitativePCRresultsshowedthatLGR8expressionbegantoriseafter80daysand150dto210dreachtothemaxi