半滑舌鳎和塞内加尔鳎干扰素调节因子基因的克隆与表达分析

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1、中国海洋大学硕士学位论文半滑舌鳎和塞内加尔鳎干扰素调节因子基因的克隆与表达分析姓名：刘万建申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：史成银；李赟201206半滑舌鳎和塞内加尔鳎干扰素调节因子基因的克隆与表达分析摘要我国是水产养殖大国，其中海水养殖鱼类作为养殖业的一大类取得了快速的发展。近几年，半滑舌鳎和塞内加尔鳎作为一种新型的海水养殖种类而迅速发展起来。目前，我国海水养殖业中仍然存在着各种问题，再加上病害的日益严重，己成为制约我国海水养殖鱼类发展的关键问题，给半滑舌鳎和塞内加尔鳎的养殖业带来了较大的经济损失。干扰素调节因子作为多功能转录因子在干扰素的转录调

2、控、病原体的免疫反应等方面起着重要的作用。因此，对半滑舌鳎和塞内加尔鳎干扰素系统的研究在其病毒性疾病的防治方面有重要的意义。本文分别选取半滑舌鳎和塞内加尔鳎为研究对象，采用反转录聚合酶链式反应的方法并结合同源克隆技术和cDNA序列末端快速扩增技术，分别克隆得到了半滑舌鳎IRF．1、IRF．2、IRF．7和塞内加尔鳎刀陋．1、IRF．2、IRf．7基因的全长cDNA序列。半滑舌鳎II心．1全长cDNA序列共1456bp，开放阅读框(ORF)全长810bp，编码269个氨基酸，5’非翻译区长105bp，3’非翻译区长54lbp；其基因组DNA全长3008bp，

3、共包括10个外显子和9个内含子。半滑舌鳎IIu．2基因的c跏叭全长1620bp，包含89bp的5’非翻译区，999bp的开放阅读框，532bp的3’非翻译区，其中OI江包含332个氨基酸残基的多肽。半滑舌鳎IRF．7基因的cⅨqA全长为1957bp，包含48bp的5’．非翻译区、l302bp的开放阅读框和607bp的3’．非翻译区，其中开放阅读框编码433个氨基酸残基的多肽。塞内加尔鳎II心．1的cDNA全长163lbp，包含143bp的5’非翻译区、600bp的3’非翻译区和888bp的开放阅读框，其中开放阅读框编码295个氨基酸残基的多肽，其基因组DN

4、A序列全长3480bp，包含10个外显子和9个内含子序列。塞内加尔鳎IRF．2基因的cDNA全长1923bp，包含84bp的5’非翻译区、987bp的开放阅读框和852bp的3’非翻译区，其中开放阅读框编码328个氨基酸残基的多肽。塞内加尔鳎IRF．7cDNA全长2220bp，包含64bp的5’非翻译区、1287bp的开放阅读框和3’非翻译区包含869bp，其中开放阅读框编码428个氨基酸的多肽。氨基酸序列分析表明，与其它硬骨鱼类相似，半滑舌鳎和塞内加尔鳎IRF．1、IRF．2和IRF．7基因的氨基酸序列都包含一典型结构特征——DNA结合域；另外，IRF．

5、2的氨基酸序列还包括转录活化域和转录抑制域，IRF．7的氨基酸序列还包含Il江相关域和丝氨酸富含域。氨基酸序列比对结果表明，半滑舌鳎和塞内加尔鳎与其它硬骨鱼类的II江．1、IRF．2和IRF．7均具有较高的同源性。系统进化表明，半滑舌鳎和塞内加尔鳎IRF一1和IRF一2同属于IRf．1亚家族，但处在两个不同的分支上，而半滑舌鳎和塞内加尔鳎IRF．7属于IRF．7亚家族。为了解II强．1、刀妞．2和IRF．7基因在健康半滑舌鳎和塞内加尔鳎各组织中的转录特征，我们利用R-T-qPCR方法分别测定了半滑舌鳎和塞内加尔鳎肝、肾、脾、心脏、肠、血细胞和鳃等7个组织的

6、目的基因的转录水平。研究结果表明，IRf．1、IRF．2和IRF．7基因在半滑舌鳎和塞内加尔鳎这些组织中均有转录。其中IRf．1基因在半滑舌鳎和塞内加尔鳎血细胞中转录水平量最高，其次是在半滑舌鳎的鳃、脾、肠和塞内加尔鳎的心脏、鳃、肠中次之；IRF．2基因在半滑舌鳎各组织中的相对转录水平都较低，而在塞内加尔鳎的鳃和肠中表达量较高；II疆-7在半滑舌鳎和塞内加尔鳎的肠中表达量最高，其次在半滑舌鳎的心脏、肾和脾以及塞内加尔鳎的脾和鳃中表达量也较高。为进一步探究IRF．1、IRf．2和II溥．7基因在半滑舌鳎和塞内加尔鳎抗病过程中的免疫应答机制，也为探索IRF．1

7、、IRF．2和II江．7在鱼体内的表达模式及在诱导后的变化水平，我们选取试验鱼的肾、脾、肠和鳃为研究对象，检测了三种II强s基因在注射poly(I：C)后第6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h的相对转录水平。研究结果发现，经过poly(I：C)感染后四个组织中的IRf．1、II汪．2和II江．7基因转录水平均上调，并呈现出一定的规律性，即在感染后第6h开始升高，在第24h或48h分别达到最大值，随着时间的延长又恢复到初始水平。这些结果表明IRF．1、lRF．2和II江．7在鱼类的抗病毒反应中起着重要的作用。关键词：半滑舌鳎；塞内加尔鳎；干

8、扰素调节因子；基因克隆；po妙(I：c)；表达分析IIMblecu