力达霉素生物合成调节基因sgcr3地功能研究和与抗ⅳ型胶原酶单链抗体偶联地力达霉素基因工程菌株地构建

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1、中国协和医科丈学硬士论文文献综述抗肿瘤基因工程单链抗体导向药物研究进展目前，免疫治疗已成为继外科手术、化疗和放疗之后治疗肿瘤的第四种有效手段【ll。应用单克隆抗体(单抗)及其工程抗体衍生物对肿瘤进行被动特异性或非特异性免疫治疗是一个巨大和快速发展的领域。整个九十年代，创新的重组DNA技术大大地提高了鼠源抗体临床应用的有效性，并且导致了近来美国FDA批准以Ig和Fab为基础的抗体药物的浪潮。尤其是1997年以来，抗肿瘤抗体药物Rituxan、Herceptin在美国相继获批准用于临床肿瘤治疗，单抗治疗剂获得

2、了迅速发展，成为生物技术药物研究开发的新热点【2】。已批准的抗肿瘤、病毒、炎症性疾病的治疗性抗体数目不断增多，其中有30多种抗体药物己进入后期临床实验。并且FDA在2002年批准了可以用来治疗淋巴瘤药物Zevalin，这是第一个用于肿瘤免疫治疗的放射性毒素偶联的抗体药物【”。1单链抗体导向药物简介单克隆抗体具有高度的特异性，但是由于其具有的一些缺陷而妨碍了在临床上的应用嘲。其缺陷主要包括(1)完整抗体分子量大(约150kDa)，分布动力学低，对肿瘤组织的渗透能力有限；(2)大部分抗体都是鼠源性的，应用于人

3、体会产生人抗鼠抗体反应(HAMA)【4】。为了克服大分子igo的这些缺点，人们发展了许多小分子的抗体片段【5】。其中发展迅速的单链抗体(scFv)是含有完整抗原结合部位的最小抗体片段，其由一段柔性肽链将V．H和VL连接构成同。肽链连接物通常由15个或更多的氨基酸残基所组成，起到柔性链的作用。(GGGGS)3是第一个被使用的肽链连接物，后来在此基础上所发展的不同的肽链连接物被甩来组装scFv【7】。由于单链抗体分子量只相当于完整抗体的1，6，因此在某些临床应用方面较完整抗体优越：免疫原性弱，不易引起人体免疫

4、排斥反应；对实体瘤渗透能力强，有助于肿瘤靶向i可以用基因工程手段进行发酵生产，成本低；易中国协和医科大学硕士论文文献综述于结晶，可以得到蛋白的三维结构以进行结构功能关系的研究。尽管单独使用单链抗体进行肿瘤治疗就能获得令人满意的临床疗效，提高单链抗体效应子功能可以强化其疗效，这可以通过构建不同形式的单链抗体偶联物来实现。偶联的效应组份包括放射性核素、化疗药物、毒素、前药激活酶、细胞因子、双功能抗体、超抗原、光敏剂、脂质体和纳米颗粒等[8]。偶联主要是通过化学和基因工程的方法使单链抗体与效应分子偶联。化学方法

5、偶联是指用化学的方法将效应分子与单链抗体的c端或氨基酸残基连接，本文主要介绍采用基因工程的方法将单链抗体和效应分子通过融合表达进行偶联，即用基因工程的方法将效应分子与单链抗体的C端连接，单链抗体仍然具有和完整抗体或单价的Fab片段同样的亲和力。在构建融合蛋白时，为了使两部分结构的空间构象不至于相互影响，还需要在中间用一段柔性的肽链连接【9】。这些单链抗体偶联物利用单链抗体对肿瘤的高度特异性实现对肿瘤的靶向性、选择性治疗，同时减轻对正常组织的毒副作用t101，实验研究表明，单抗偶联物对移植于裸鼠的人体肿瘤生

6、长有抑制作用，偶联物与相应的游离药物相比具有更高的疗效或显示较低的毒性Ill'l21．图1基因工程单链抗体偶联物示意图Fig．1StructureofbioengeeredscFvimmunoconjugates2基因工程单链抗体导向药物的分类和构成4中国协和医科大学硕士论文文献综述如上所述，单链抗体可以通过与不同形式的偶联物来强化其抗肿瘤疗效，并且有的偶联物还具有靶向性之外的辅助功能。偶联物中单链抗体片段起载体的作用，偶联物为效应分子，通常是放射性核素、化疗药物、毒素、前药激活酶、细胞因子、双功能抗体、

7、超抗原等。根据效应分子的不同单链抗体偶联物主要可以分为单链抗体一毒素偶联物、单链抗体一细胞因子偶联物、单链抗体一超抗原偶联物、单链抗体一酶偶联物、双体异性单链抗体(bsFv)等。2．1单链抗体一毒素偶联物单链抗体一毒素偶联物，是指将单链抗体与细胞毒素通过体外DNA重组获得的熏组免疫毒素，单链抗体作为具有特异性导向性的载体，毒素为具有高度特异性而对正常细胞的低毒性的重组毒素分子。用于构建的毒素多来源于假单胞杆菌外毒素(psedomonasexotoxin，PE)，蓖麻毒素(ricin)，和破伤风毒素(tet

8、anustoxin)等[13,14,15】。例如制备与人P53的CD8(+)细胞毒T淋巴细胞中的TCR同源的功能性单链抗体(P53TcRscFv)与假单胞杆菌外毒素A的衍生物PE38融合得到TCRscFv-PE38重组免疫毒索，该毒素能与表达P53特异性小肽的抗原提呈细胞发生特异性的结合，并以多肽依赖性的方式特异性的杀伤APCIl6]。这说明单链抗体可以作为导向载体携带细胞毒效应分子到达靶细胞并且有选择性的杀伤靶细胞，有效地进