aβ寡聚体特异性单链抗体的构建、表达和生物学功能地地研究

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1、中文摘要摘要：目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)是一种引起老年人痴呆的最常见的神经退行性疾病，目前尚无有效的治疗方法。D淀粉样肽(13-amyloidpeptide，Ap)寡聚体是AD发生的早期始动因子。本研究拟在Ap寡聚体特异性单抗A8基础上，构建单链抗体(singlechainfragmenvariant，scFv)，表达并初步探讨其生物学功能。方法：以A8单抗轻重链可变区基因为模板，通过重叠延{申PCR的方法构建scFv的基因片段，同时引入不同的连接肽(Linker)序列，(G4S)3或

2、者p2A，拼接得到多种形式的scFv片段。通过原核表达体系快速验证所构建单链抗体基因片段表达产物的活性，并且构建真核表达载体。脂质体法分别转染人宫颈癌细胞(Hela)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，潮霉素加压筛选，筛选稳定表达抗AD寡聚体的单链抗体细胞株。通过间接ELISA矛I斑点印迹分析所得抗Ap寡聚体scFv的抗原识别能力，通过体外实验研究所得scFv的细胞保护作用以及超微病理改变。结果：成功获得了scFv的3个基因片段，VL．(G4S)3．VH、VH一(G4s)3．vL和VL-p2A．VH。选取-Hfi2个基因片段构建

3、原核表达载体，获得30kD的目的蛋白，经过镍亲和层析纯化，Westemblot结果显示纯化的scFv正确表达；间接ELISA结果表NVH．(a4s)3．VL滴度为1：32000，VL一(G4s)3一VH滴度为1：8000。成功构建3个真核表达载体(pSecTa92／HygroA—VL一(648)3．VH、pSecTa92／HygroA．VH一(G4S)3．VL,11pSecTa92／HygroA-VL-p2A．Ⅶ)；获得了2株稳定表达scFv的细胞株Hela—VL—p2A-VH幂IICHO—VL．(G4S)3．VH。间接E

4、LISA乘l斑点印迹结果表明所分泌的细胞上清具有抗原识别能力，体外实验显示其具有阻断和抑锘1JAl342寡聚体的细胞毒性作用。其中一细胞株Hela．VL．p2A．VH较CHO—vL．(G4s)3．vH表达量和识别能力相对强。结论：成功构建TAl3寡聚体单链抗体表达载体，通过原核和哺乳动物细胞系统正确表达；建立了2株稳定表达所述单链抗体的细胞株；所分泌的细胞上清具有抗原识别能力，能够阻断A13寡聚体的细胞毒性作用，为进一步应用奠定基础。关键词：阿尔茨海默病；A13寡聚体；单链抗体分类号：Q5；R741ABSTRACTABST

5、RAC’I’：Objects：Alzheimer’Sdisease(AD)isakindofcommonneurodegenerativediseasewhichcausesdementiainagedpeopleandtherearenoeffectivetreatmentmethods．A13oligomersarethecausativeagentintheearlystageofAD．OnthebasisofA13oligomers_specificmonoclonMantibodyA8establishedino

6、urgroup，wearegoingtoconstructandexperesstheA8derivedsinglechainfragmentvariant(scFv)，andverifythebiologicalfunction．Methods：InordertoconstructthescFvgene，thevariableregionsoflightandheavychainfromA8wereusedasthetemplate，andsplicingoverlapextensionpolymerasechainre

7、action(SOE-PCR)wasexploidedtogetthescFv．Asforthelinkersequence，weused(G4S)3orp2Asequelae．ProkaryoticexpressionsystemwasconstructedjusttoV耐矽thebiologicalactivityofscFvbyaquickmethod．Thenweconstrctedtheeukaryoticexpressionvectors．HelaandCHOcellsweretransfectedwithLi

8、pofectamine2000andscreenedwithhygromycinB．ThesupernanentwasdetectedbyindirectELISAanddotblot，anditsfunctionwasidentifiedbycellabilityassayandultrapathol