犬尿氨酸途径在达托霉素生物合成中的功能研究

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1、西南大学硕士学位论文犬尿氨酸途径在达托霉素生物合成中的功能研究姓名：王磊申请学位级别：硕士专业：药物分析学指导教师：胡昌华；廖国建20120526捅璺犬尿氨酸途径在达托霉素生物合成中的功能研究硕士研究生王磊指导老师胡昌华教授廖国建副教授摘要达托霉素是由玫瑰孢链霉菌(溉p幻醪声船，∞8∞印，．淞)产生的一种天然环脂肽类抗生素。2003年FDA批准其用于革兰氏阳性致病菌引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，随后于2006年批准治疗由金黄色酿脓葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的菌血症和右侧心内膜炎。达托霉素通过破

2、坏细菌细胞膜快速杀死病原菌，有效避免细菌对其产生耐药性以及与其它抗生素的交叉感染，逐渐成为治疗革兰氏阳性耐药茵引起的感染疾病首选用药。目前关于达托霉素的研究主要集中在两方面：第一，通过传统的菌种选育方法和发酵工艺优化大幅提高达托霉素的产量，这些研究为达托霉素的工业化生产提供重要基础；第二，通过．S：，．傩eo印Dr淞的组合生物学研究寻找疗效更优的达托霉素结构类似物，这些研究揭示了达托霉素母核上各氨基酸对其抑菌活性的影响，为寻找疗效更佳的达托霉素类似物提供方向。大量研究揭示达托霉素母核氨基酸对其抑菌活性有重要

3、影响，这些氨基酸在＆加sPD印D，．淞中的生物合成途径对达托霉素的生物合成有重要作用。犬尿氨酸是达托霉素的特征氨基酸，是其母核的重要组成部分。在已知抗生素中，犬尿氨酸仅发现于达托霉素类抗生素中，它对达托霉素的抑菌活性有非常重要的影响，但关于它在S，DsPD妒D，．淞中的生物合成途径尚未报道。在许多微生物中，犬尿氨酸是由色氨酸通过犬尿氨酸途径分解代谢生成，是此途径重要的中间产物。犬尿氨酸作为达托霉素生物合成的重要前体，对其生物合成具有重要作用。因此，研究犬尿氨酸在&，∞Pos矽，．淞中的生物合成途径有着非常重

4、要的意义。我们推测S，．∞e唧D，螂NRRI，11379(v4)中可能存在犬尿氨酸途径，这条途径生成的犬尿氨酸可能为达托霉素生物合成提供前体。研究犬尿氨酸途径以及此途径对达托霉素生物合成的影响将为代谢工程手段改造菌株和寻找疗效更佳的达托霉素类似物提供重要理论依据。西南大学硕士学位论文目的：本文旨在研究&聊印印D，．姗NRRI，11379(v4)中犬尿氨酸的生物合成途径和此途径关键基因对达托霉素生物合成的影响，为改造＆厂osPo印D，．淞菌株以及寻找疗效更佳的达托霉素类似物提供依据。方法：1．本研究首先尝试建

5、立大肠杆菌介导的遗传转化系统，优化接合转移条件，如优化抗生素浓度、抗生素覆盖时间等。2．分析SroseD印or榔NRRI，11379(v4)基因组序列，通过生物信息学分析找出参与犬尿氨酸生物合成途径的关键基因。设计引物，分别克隆参与此途径的重要基因：色氨酸2，3．力口氧酶(砌)、犬尿氨酸甲酰胺酶(妙们、犬尿氨酸酶(枷)和达托霉素生物合成基因簇上的和∥。3．设计引物分别扩增砌、印∥和枷基因两侧同源臂，用重叠PCR将两端同源臂与卡那霉素抗性基因连接。将目的片段与pKCll39载体构建砌、勿厶，和枷基因敲除质粒，

6、通过接合转移将导入＆，D船唧D，．淞NI毗11379(v4)中，接着通过温敏实验筛选发生同源双交换的基因敲除株(DM)，并进行PCR验证；扩增含有核糖体结合位点痂、劫U基因，与pSETl52载体构建砌、咖∥基因过表达载体。通过接合转移，筛选胁、勿厶，过表达株(OM)和遗传互补株(DMC)，并进行验证。重组菌株培养后收集菌液，进行生物活性检测和定量。结果：1．成功建立大肠杆菌介导的遗传转化系统，可以得到目的接合子。受体菌孢子最佳热激条件为50℃热激10mill；抗生素最佳覆盖时间为16．18h；抗生素最佳覆盖

7、浓度为安普霉素(Apr)10斗咖l和萘啶酮酸(NA)25“咖l。2．从S，osPD印计搬NIU也11379(v4)基因组中克隆出犬尿氨酸途径的三个关键基因砌(849bp)，匆矿(933bp)，枷(1233bp)以及达托霉素生物合成基因簇上的咖∥(738bp)基因。生物信息学表明^面编码色氨酸2，3．双加氧酶，JiI=睨编码犬尿氨酸甲酰胺酶，枷编码犬尿氨酸酶，这些基因序列和基因位置都较保守。另外，重组蛋白蛋吖N以犬尿氨酸为底物生成邻氨基苯甲酸，进一步确定＆阳sPD眵Dr淞N对也11379(v4)中含有犬尿氨酸

8、途径。3．成功构建胁、印泖枷敲除载体和砌、勿∥过表达载体。根据同源重组原理，温敏实验后获得阳性菌株。PCR验证结果显示相应基因敲除成功，获得敲除突变株砌DM、咖厶，DM，咖zDM，同源重组几率分别为4％、0．4％和11％。将犬尿氨酸途径第一步反应中的胁基因敲除后，达托霉素的产量降低55％；将达托霉素生物合成簇印“鼓除后产量降低58％；分别遗传回补后产量得到增加。将犬尿氨II捅要酸途径第三步反应中的句们敲除后，产量