林可霉素生物合成抗性基因的功能研究

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1、林可霉素生物合成抗性基因的功能研究第1章前言1.1林可霉素的简介林可链霉菌(StreptomycesUncolnemis)是林可霉素（Linycin)的产生菌，是美国普强公司的D.J.Manson等人于1962年首先从美国内布棱斯加州林肯市附近土壤中分离得到的。第一个被分离的林可霉素产生菌是林可链霉菌NRRL2936。林可霉素及其衍生物是一类在临床上具有重要意义的林可酷胺类抗生素，主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染，但对革兰氏阴性菌也有效，抗菌谱与红霉素相似，而且林可霉素用药途径较多，副反应较少，控制感染快，对组织和细胞的穿透力强，应用方便，不需做皮试，是较

2、有前途的一种抗生素，林可霉素类抗生素己成为临床应用上主要的抗生素之一[2]。其氯化物克林霉素是临床上少数几个对革兰氏阴性厌氧菌有效的药物之一。我国是对林可霉素及其衍生物研究较早的国家之一，从1980年幵始批量生产，到1992年全国已有生产厂家43个，年产量达800多吨，在世界林可霉素的生产中占据重要的地位受销售市场的影响，现在我国共有林可霉素生产厂家十家左右，比较大的有华北制药厂，院北制药厂，南阳化学制药厂等。通常人们所说的林可霉素是指林可霉素A，此外林可霉素还有其它的组分如林可霉素B、林可霉素C、林可霉素D和林可霉素S等。林可霉素的分子量为406.56，其

3、结构组成包括氨基酸（脯氨酸的结构类似物，酷氨酸的衍生物：丙基-L-古酸液，PPL)结构和糖结构（氨基辛糖:a-甲硫基林可胺，a-MTL)(图1-1)。在发现林可霉素之前，另一种林可酸胺抗生素天青菌素已被报道，后来这两种抗生素的结构相似性得以鉴定。林可霉素的作用机制是通过与核糖体50S亚基23SrRNA的中心环相结合而抑制蛋白质生物合成过程中的转移定位，因此通过影响蛋白质的合成抑制细菌生长。1.2林可霉素生物合成研究进展研究人员曾先后从林可霉素高产菌株林可链霉菌78-11及其野生型菌株林可链霉菌NRRL2936中克隆了其完整的生物合成基因簇，并进行了比较分析。

4、结果表明该基因簇长约35kb，包含30个幵放阅读框，由27个可能的生物合成及调控基因(Imb)和3个可能的抗性基因（/L37°C过夜培养的大肠杆菌至1.5mL离心管，12000rpm离心30sec收集菌体。向菌体沉淀中加入150jrpm离心2rnin，室温下放置5min，去除残余的乙醇。将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，在吸附柱的膜中央加入30~50L的超纯水或TE，静置1min后，12000rpm离心2min，收集的液体即为目的DNA片段溶液。第3章MFS转运蛋白基因ImrA的功能分析.......233.1引言.......233.2结果与

5、分析.......243.3小结与讨论.......31第4章ABC转运蛋白基因ImrC的功能分析.......324.1引言.......324.2结果与分析.......324.3小结与讨论.......38第5章rRNA甲基转移酶基因ImrB的初步研究.......405.1引言.......405.2结果与分析.......415.2.1NRRL2936中缺失突变株XJJ13的构建.......415.2.2LC-G中野生型ImrB过表达突变株XJJ11的构建.......425.3小结与讨论.......43第5章rRNA甲基转移酶基因limB的初

6、步研究5.1引言林可霉素的作用机制是通过与核糖体50S亚基23SrRNA的中心环相结合而抑制蛋白质生物合成过程中的转移定位，从而通过影响蛋白质的合成抑制细菌生长。由于LmrB与23SrRNA的2058位腺嘿呤氮甲基转移酶有很高的同源性，我们推断LmrB可能是通过修饰23SrRNA使其不能与林可霉素结合而产生林可霉素抗性。本人所在课题组对两株林可链霉菌，野生型NRRL2936和工业高产菌LC-G进行了全基因组测序，通过序列比对发现LC-G中的/n4缺失、回补以及过表达突变株，bnrA缺失后，林可霉素产量、抗性及林可霉素生物合成基因转录水平都显著下降，回补后林可

7、霉素产量有所回升。过表达后，林可霉素产量、抗性及林可霉素生物合成基因转录水平也都有明显的升高。这些结果充分说明/rC缺失、回补以及过表达突变株，mrC缺失后，林可霉素产量、抗性及林可霉素生物合成基因簇中结构基因转录水平也有所下降，回补后林可霉素产量有所回升。/rC是林可霉素抗性基因，但其编码的蛋白转运林可霉素能力并不强，并且是在高浓度的林可霉素的环境中才能外排林可霉素，因而其对林可霉素的抗性及转运的贡献没有同样编码转运蛋白的大。