岗梅三萜皂苷生物合成相关cyps基因的挖掘与功能研究

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1、分类号学校代号１０５７２＾ＵＤＣ６１０密级号２０１２１１０６４５７学ｄ／抑Ｉ中虔讀乂＃＇）＊咐扣、￡…扣Ｇｕａｎ良ｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉ打ｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ硕±学位论文岗梅兰聰皂昔生物合成相关ＣＴ的基因的挖掘与功能研究学位申请人罗秀秀指导教师姓名徐巧专业名称药物分析学申请学位类型科学学位论文提交日期２０１５年５月＇Ｖ－，？＂，．．广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑

2、堇声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工巧所取得巧成果。除文中己经特别加＾注，本｛＾明哥用的巧容外絶文不含巧巧其他个人或集俸已经发表或撰写过的作品成果。对本文的挪巧做出重要贾戰的个人和集体＾。，巧百在文中１＾１明确方式綜明并致谢本人完全意识到本声閔的法律结柔由本人承担。学位馆支作者签名＇韻曰期：幼您年《月曰／关于学位论文使用授枚的汚明本人完全了解广州中度药大学有关保留使用学栓论文的規定，同意学较保。留或向国家有关部口机巧送交论文的复印件和电子

3、版，允许被査圖巧借阔本人授扳广州中医荡太学可抖将本学極论文的全部或部分内容编入有关数据摩进行捡索、，可｛＾１采用影印缩印或其他复印手段保存巧汇编本学位论文。（娛密论文在解密房应遵守化规定）、论文作蓄签名拝论文导师签名２Ｇ＞曰期／５；年《月Ｉ曰摘要目的：Ｈ荫皂昔为岗梅的主要药效活牲成分，但结构复杂、分离困难等问题限制了这类成分的获取，因此研究其生物合成具有重要意义。本研究的目的是从岗梅（ｉｆｅｊｃａ聊她ａ（Ｈｏｏｋ．ｆ．ｅｔＡｍ．）Ｃｈａｍｐ．ｅｘＢｅｎｔ

4、ｈ）转录组中发掘可能与岗梅Ｈ萌皂昔生物合成相关的关键酶基因—细胞色素Ｐ４５０单加氧酶（ＣＹＰｓ）基因，．并对发掘出的候选基因进行功能鉴定，阐明岗梅兰荫皂巧生物合成下游途径的氧化修饰机制，为探索Ｈ萌皂巧的人工生物合成奠定基础。方法：１．ＣＦＰｓ基因的筛选本研究利用口个已鉴定的Ｈ拖合成相关ＣＹＰｓ的氨基酸序列作为参考对象，对岗梅根转录组数据做ＢＬＡＳ咕筛选同源性大于４０％的候选基因；将候选ＣＹＰｓ和己鉴定的ＣＹＰ一ｓ的氨基酸序列进行系统发生分析ＫＥＧＧ代，结合谢通路进步筛

5、选可能的ＣＪＴｓ基因。２．基因克隆和质粒构建用试剂盒方法提取岗梅根总ＲＮＡ，反转录制备ｃＤＮＡ后，通过ＰＣ民的方法获得ａ－目的基因。用Ｇｔｅｗａｙ克隆、传统的酶连接克隆或ＩｎＦｕｓｉｏｎ克隆的方法构建目的基因的表达质粒。３．蛋白功能验证研究将目的基因的表达载体用醋酸裡方法转染至能特异性表达拟南芥细胞色素Ｐ４５０’ＷＡＴ还原酶（ＣＰ艮）的酿酒酵母茵株＆ｃｅｗｖ：■地／ｅｌｌ中，用２％半乳糖诱导重组酵母表达，通过ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ验证蛋白的表达情况。取Ｗｅｓｔｅ

6、ｒｎＢｌｏｔ验证过的阳性转化子ＷＡＴ＂／ＥＸＰ４１０（候选、姓＋ＥＳＣ－－４（ＡＳｐＣＹＰ表法菌株）ＷＡＨｌ／ｐＥ３０７９ＰＴＲＰ１０与候选ＣＹＰ共表达苗株）及其他对照茵株进行诱导表达后，用ＭＳ方法检测它们的代谢产物。结果：１．ｃｍ候选基因综合ＢＬＡＳＴｐ、系统发生分析及ＫＥＧＧ代谢通路分化筛选出４个可能参与岗梅Ｈ巧皂巧生物合成的ＣｒＡ基因－－－２４－；ＣＬ４１０．Ｃｏｎｔｉｌ／香树脂醇径化酶ｇ可能编码ａｐ；ＣＬ３０－－１０．Ｃｏｎｔｉｇｌ和ＣＬ３０１０．

7、Ｃｏｎｔｉｇ２可能编码具有催化ａ香树脂醇、Ｐ香树脂醇、羽扇－－豆醇骨架Ｃ２８位氧化的氧化酶ＣＬ３－００８．Ｃｏｎｔｌ／；ｉｇ可能编码具有催化ａｐ香树脂醇Ｃ－２１１３位环氧化的氧化酶，为接下来的基因功能鉴定奠定基础。，２．候选基因和ＣＺ：厕的克隆和质粒构建选取两个筛选出的ＣＪＴｓ候选基因ＣＬ４１０．Ｃｏｎｔｉｇｌ和ＣＬ３０１０．Ｃｏｎｔｉｇｌ（分别命名ＩＷ０－ＪＧＥＭ－ＴＥａｓ４０为ＣＵ）进行克隆，成功构建了克隆质粒ｐｙ１化及酵母１０ＳＣ－ＴＲＰ－４１０ＥＳＣ－ＴＲＰ－３０

8、－表达质粒ＰＥＸＰ４、阳、ｐ１０。成功获得了Ｃ以Ｊ０７的全长一编码区１５４５ｂ码个５１４ａａ０ｂ，，共ｐ，编的蛋白，幻的全长编码区共１４４ｐ一４７６编码个ａａ的蛋白。３－．ＣＬ４１０１蛋白功能ＷｅｒｓｔｅｎＢｌｏｔ结果显示，在半乳瞎诱导下，重组酵母ＷＡＴｌｌ／ｐＥＸＰ４１０能够产生与－４ｈ时左右达预期大小相符的ＣＬ４１０１蛋白，蛋白表达量由０时刻开始逐渐増多，在ＷＡＴ－－到顶峰后逐渐降低ｌｌ／ＥＸＰ３０７９＋ＥＳＣＴＲ