西洋参中人参皂苷相关功能基因的鉴定分析与表达研究

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1、西洋参中人参皂苷相关功能基因的鉴定分析与表达研究StudyontheidentificationandexpressionoffunctionalgenesrelatedtoginsenosidebiosynthesisinPanaxquinquefoliusL.作者姓名：王乐专业名称：农业生物环境与能源工程研究方向：农业生物资源保护与利用指导教师：赵寿经教授学位类别：工学博士培养单位：生物与农业工程学院论文答辩日期：2015年5月31日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位王丽教授东北师范大学主席：王丽教授东北师范大学陈光教授吉林农业大学委

2、员：陈光教授吉林农业大学于海业教授吉林大学于海业教授吉林大学盲审专家杨印生教授吉林大学盲审专家赵寿经教授吉林大学摘要西洋参是一种名贵的多年生草本植物，具有美容养颜、抗疲劳、抗衰老等功效。人参皂苷是西洋参中行使其药理学活性功能的主要代谢产物。研究表明达玛烷型人参皂苷为人参皂苷的主要成分，且达玛烯二醇合成酶(DS)、细胞色素氧化酶P450中的原人参二醇合成酶(D12H)与原人参三醇合成酶(P6H)在达玛烷型人参皂苷的合成途径中起关键作用。前体物质2,3-氧化角鲨烯在DS的催化作用下生成达玛烯二醇，经D12H的C-12羟基化作用生成原人参二醇，再由P6H在C-6的羟基化作用合成原人参三醇。

3、原人参二醇与原人参三醇可以在糖基转移酶的催化作用下形成最终的单体皂苷。西洋参中的原人参二醇合成酶基因(PqD12H)的鉴定分析工作已由本课题组完成，而达玛烯二醇合成酶基因以及原人参三醇合成酶基因的研究工作还没有具体报道。本研究从西洋参中达玛烯二醇合成酶基因与原人参三醇合成酶基因的克隆鉴定入手，完成了基因的克隆、序列分析、异源表达鉴定、异源共表达分析和超表达调控研究等工作。完善了对西洋参中人参皂苷生物合成途径的研究，为人参皂苷的异源合成奠定了基础，同时也对西洋参中人参皂苷合成的表达调控及种质创新具有一定的参考价值。主要研究结果如下：1.根据已发表的人参与三七中的达玛烯二醇合成酶基因、原

4、人参三醇合成酶基因的保守序列设计引物，利用RACE技术成功的获得了西洋参中的达玛烯二醇合成酶基因与原人参三醇合成酶基因的全长序列，经生物信息学方法分析后分别命名为PqDS与CYP6H，并已注册GenBank获得检索号，分别为KC316048与KC190491。2.将PqDS与CYP6H的开放阅读框序列克隆扩增，利用酶切连接技术构建各自的异源表达载体，再转化至酿酒酵母感受态细胞中分别进行异源表达鉴定。提取菌液代谢物进行高效液相检测，结果表明两个基因均能成功的异源表达具有活性功能的蛋白酶。3.分别构建基因PqDS、PqD12H与CYP6H的异源表达载体pAUR123-PqDS、pAUR1

5、23-PqD12H与pAUR123-CYP6H，然后以酿酒酵母菌作为受体菌，按顺序分阶段的将各重组表达载体转入同一酿酒酵母细胞中构建异源共表达工程菌yeast-pAUR123-PqDS-PqD12H-CYP6H。提取菌液代谢物进行高效液相检测，结果表明基因PqDS、PqD12H与CYP6H可以在酿酒酵母菌中异源共表达合成原人参三醇，并且产量可以达到13.85μg/gFW。4.此外，还利用酶切连接技术构建了基因PqDS与CYP6H的超表达载体pBI121-PqDS与pBI121-CYP6H，并转化感受态的发根农杆菌A4形成各自的超I表达工程菌A4-pBI121-PqDS与A4-pBI1

6、21-CYP6H，经侵染西洋参根片诱导形成超表达发根系后，检测总皂苷及达玛烷型单体皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1的含量变化用以分析基因PqDS与CYP6H的超表达对皂苷合成的表达调控作用。结果表明PqDS的超表达使各种单体皂苷的含量有15.44%-46.55%不同程度的增加，并使总皂苷含量增加24.56%；基因CYP6H的超表达会提高原人参三醇型皂苷的含量17.80%-19.9%不等，与此同时减少原人参二醇型皂苷的含量4.46%-11.26%，并且使总皂苷的含量增加9.24%。关键词：西洋参，达玛烯二醇合成酶，原人参三醇合成酶，异源共表达，超表达IIAbstractPa

7、naxquinquefoliusL.isoneofthepreciousperennialherbsandwellknownforitsoutstandingeffectivenessofanti-fatigue,anti-aging,beautymaintenanceandsoon.GinsenosidesarethoughttobethemainmetabolitesofPanaxquinquefoliusL.foritspharmacological