犬尿氨酸途径在达托霉素生物合成中的功能分析

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1、西南大学硕士学位论文目的：’．本文旨在研究&roseosporusNRRL11379(v4)中犬尿氨酸的生物合成途径和此途径关键基因对达托霉素生物合成的影响，为改造＆roseosporus菌株以及寻找疗效更佳的达托霉素类似物提供依据。方法：1．本研究首先尝试建立大肠杆菌介导的遗传转化系统，优化接合转移条件，如优化抗生素浓度、抗生素覆盖时间等。2．分析SroseosporusNRRL11379(V4)基因组序列，通过生物信息学分析找出参与犬尿氨酸生物合成途径的关键基因。设计引物，分别克隆参与此途径的重要基因：色氨酸2，3．

2、力口氧酶(tdo)、犬尿氨酸甲酰胺酶(妙妒、犬尿氨酸酶(枷)和达托霉素生物合成基因簇上的咖矶3．设计引物分别扩增taro、dptJ和kyn基因两侧同源臂，用重叠PCR将两端同源臂与卡那霉素抗性基因连接。将目的片段与pKCll39载体构建taro、咖tJ和枷基因敲除质粒，通过接合转移将导入&roseosporusNRRL．11379(v4)中，接着通过温敏实验筛选发生同源双交换的基因敲除株(DM)，并进行PCR验证；扩增含有核糖体结合位点tdo、dptJ基因，与pSETl52载体构建tdo、dptJ基因过表达载体。通过接合

3、转移，筛选tdo、dptJ过表达株(OM)和遗传互补株(DMC)，并进行验证。重组菌株培养后收集菌液，进行生物活性检测和定量。结果：1．成功建立大肠杆菌介导的遗传转化系统，可以得到目的接合子。受体菌孢子最佳热激条件为50℃热激10mira抗生素最佳覆盖时间为16．18h；抗生素最佳覆盖浓度为安普霉素(Apr)10删和萘啶酮酸(NA)25“g／ml。2．从＆roseosporusNRRL11379(v4)基因组中克隆出犬尿氨酸途径的三个关键基因taro(849bp)，砂矿(933bp)，kyn(1233bp)以及达托霉素生

4、物合成基因簇上的咖tJ(738bp)基因。生物信息学表明taro编码色氨酸2，3．双加氧酶，椭码犬尿氨酸甲酰胺酶，kyn编码犬尿氨酸酶，这些基因序列和基因位置都较保守。另外，重组蛋白KYN以犬尿氨酸为底物生成邻氨基苯甲酸，进一步确定SroseosporusNRRL11379(v4)中含有犬尿氨酸途径。3．成功构建tdo、dptJ和gyn敲除载体和tdo、dptJ"x：立_表达载体。根据同源重组原理，温敏实验后获得阳性菌株。PCR验证结果显示相应基因敲除成功，获得敲除突变株tdoDM、dptdDM、kynDM，同源重组几率

5、分别为4％、0．4％和11％。将犬尿氨酸途径第一步反应中的tdo基因敲除后，达托霉素的产量降低55％；将达托霉素生物合成簇咖U鼓除后产量降低58％；分别遗传回补后产量得到增加。将犬尿氨II捅蛩酸途径第三步反应中的枷敲除后，产量增加33．75％。：将tdo、咖奶立表达载体导入&朋PDspD，．1岱'NRRL11379(v4)基因组后，获得砌OMF}【IdptJOM，产量分别增加了7％和112％。结论：本文结果显示＆roseosporusNRRL11379(V4)中存在犬尿氨酸途径，此途径通过提供犬尿氨酸前体而影响达托霉素生

6、物合成。关键词：达托霉素；&roseosporus=犬尿氨酸；犬尿氨酸途径；生物合成IⅡ西南大学硕十学位论文AbstmctTheimpactofkynureninepathwayondaptomyclnDlosynthesls'●一，Postgraduate：LeiWangSupervisor：ProfessorChanghuaHuAssociateProfessorGuojianLiaoAbstractDaptomycinisallacidlipopeptidewhichisderivedfromfermentatio

7、nbyanonribosomalpeptidesynthetasemechanismofStreptomycesroseosporus．FDAapproveddaptomycinforthetreatmentofcomplicatedskinandskinstructureinfectionscausedbyGram—positivepathogensin2003andforthetreatmentofbacteremiaandright-sidedendocarditiscausedbyStaphylococcusau

8、reusandmethicillin．resistant＆aureus(MRSA)in2006．ItsmodeofactionisdestroybacterialmembranefunctionSOthatrapidlykillsGram-positivebacteriawithoutcross-resistance