转录因子nanog基因在乳腺癌干细胞中的表达及其功能研究

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1、上海交通大学医学院2011级博士研究生论文上海交通大学博士学位论文转录因子Nanog基因在乳腺癌干细胞中的表达及其功能研究TheExpressionandFunctionofTranscriptionFactorNanogInetXpreSSIOnana卜UnCtlOnOtIranSCrIDtlOn卜aCtOrNanOgGeneinBreastCancerStemCelIs研究生：—堂昙．亍'-指导教师：学科专业：胡春0117209120张凤春教授肿瘤学研究方向：肿瘤干细胞与肿瘤个体化治疗培养单位：瑞金医院申请学位级别：医

2、学博士(科学学位)资助基金项目：国家自然科学基金(81172522)论文提交日期：2014年4月上海交通大学医学院2011级博士研究生论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。聩们签E糍侔倒计姗西上海交通大学医学院201l级博士研究生论文上海交通大学学位论文版

3、权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于

4、不保密囤。(请在以上方框内打“√”)哮日移堋辄；侔斟卅穆锄教乳戥瑚醮日墉钼轹钥捌∈者年，个●4妇沙讼：位期学日上海交通大学医学院20l1级博士研究生论文转录因子Nanog基因在乳腺癌千细胞中的表达

5、及其功能研究摘要乳腺癌是严重危害女性生命健康的恶性肿瘤。近年来，越来越多的证据表明肿瘤中存在着一群比例较低的细胞，却可能与肿瘤的进展、耐药、复发和转移等关系密切，它们被命名为肿瘤干细胞。转录因子Nanog最初发现于胚胎干细胞中，它是维持胚胎干细胞自我更新和多能性的关键因子，是干细胞自我更新、增殖，同时保持其分化潜能所必需的。最新的研究表明，Nanog在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中的表达水平明显升高，它在肿瘤的发生发展中起到了重要的调控作用，提示它可能成为一个潜在的治疗靶点。目前己知，Nanog在胚胎干细胞中的功能在于维持其自

6、我更新和多向分化潜能，而在肿瘤干细胞，特别是乳腺癌干细胞中的表达特征及功能一直处于未知状态，尚未见文献报道。Nallog在乳腺癌干细胞中是否也具有其在胚胎干细胞中的相似功能?这已成为基于Nanog为靶点的乳腺癌干细胞靶向治疗研究进程中首先需要解答的问题。为此，本课题就转录因子Nanog基因在乳腺癌干细胞中的表达特征及其所具有的功能等问题进行了初步研究。目的：1．以乳腺癌细胞系为模型，建立以细胞表面标志物cD44+cD24一和悬浮微球体培养的乳腺癌干细胞分选、富集的方法，阐明转录因子Nanog基因及其不同转录本在乳腺癌干细胞

7、中的表达特征；2．针对人Nanog基因序列，设计并构建Nanog—RNAi慢病毒载体，为后续基因功能研究奠定基础；3．分析转录因子Nallog在乳腺癌干细胞中所具有的功能，对以Nanog为靶点的乳腺癌干细胞靶向治疗进行初步探索。方法：1．Nanog在乳腺癌干细胞中的表达：1)以细胞表面标志物cD44+cD24一对乳腺癌细胞系进行FACS分选；2)体外无血清干细胞培养环境对乳腺癌细胞系进行悬浮微球体培养以富集乳腺癌干细胞；3)WestemBlot和免疫荧光检测微球体和上海交通大学医学院2011级博士研究生论文贴壁细胞中Nan

8、og的表达差异及其细胞定位；4)Real．timePCR检测Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、CD44、wnt2、Notchl和ABCG2等干细胞相关基因在CD44+CD24一和non．CD44+CD24一细胞中的表达差异，以及Nanog三个不同转录本在CD44+cD24一细胞中的表达差异。2．Nanog—RNAi慢病毒载体的构建与鉴定：1)针对人Nanog基因的siRNA靶点设计4个靶序列，合成单链DNA01igo片段后，将单链DNA01igo的正义链和反义链混合物制备成双链DNA01远o；2)使用AgeI和Ec

9、oRI限制性内切酶对慢病毒质粒pGC—Lv载体进行双酶切后，与制备的双链DNAoligo连接，构成重组质粒，转化感受态细胞，对生成的阳性克隆进行PCR鉴定及测序；3)采用三质粒系统共转染293T细胞，收集细胞上清液浓缩并测定病毒滴度；4)用构建的Nanog—shRNA慢病毒载体感染目的细胞，Real—t