甜瓜蒂中葫芦素b葡萄糖苷的微生物转化研究

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1、ZhejiangUniversityofTechnologyADissertationSubmittedforMasterofMedicineTitle：MicrobialTransformationofCucurbitacinB．glucosidefromPedicellusMeloAuthor：LiS丛Adviser：——————————AssociateprofessorMeiJianFeng——————————Major：—————M———i—c——r—o——b——i—a——l——a——n——d———B——i—o——c——h——e——m———i—

2、c——a—l———P——h——a—r——m———a—c——eutics——一CollegeofPharmaceuticalScience，iangUniversityofTechnology,May，2014浙江工业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责

3、任。作者签名：态钙，日期：M年r月．2-7Et学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在年解密后适用本授权书。，2、不保密耐。(请在以上相应方框内打“4”)作者签导师签日珂1月月．nf浙江工业大学药学院2014年硕士学位论文甜瓜蒂中葫芦素B葡萄糖苷的微生物转化研究摘要葫芦素B具有抗

4、肿瘤、抗肝损害、抗化学致癌、增强机体免疫力等多种生物活性，目前临床用于慢性肝炎和原发性肝癌的辅助治疗。葫芦素B的生产方法主要是从中药甜瓜蒂中提取，但是产率较低。甜瓜蒂中也含有葫芦素B葡萄糖苷，其含量几乎接近于葫芦素B。对于糖苷键连接的化合物，由于人体缺乏相应的酶，不能将其水解为苷元而吸收利用，因此葫芦素B葡萄糖苷未能作为药物成分加以利用。微生物有着非常强大的酶系和分解转化能力，通过微生物生长代谢所产的酶将葫芦素B葡萄糖苷转化为葫芦素B，可以提高甜瓜蒂提取药用成分的利用率，且具有反应条件温和，专一性强、环境友好等优点。本文首次采用微生物酶法生物转化来自甜瓜

5、蒂中的葫芦素B葡萄糖苷，得到葫芦素B，并对其转化工艺进行了优化研究，提高产率。首先，从土壤和污水样品中分离纯化得到45株霉菌和放线菌菌株，以这些菌株发酵所得的粗酶液为催化剂，生物转化处理从甜瓜蒂中提取的含葫芦素B葡萄糖苷的粗提物，比较不同菌株产酶对葫芦素B葡萄糖苷的转化能力，筛选出一株能将葫芦素B葡萄糖苷转化为葫芦素B的活性菌株RW-2。根据形态学、16SrDNA核酸序列和系统发育分析，确定该菌株为链霉菌(Streptomycessp．)。其次，以葫芦素B摩尔产率为指标，通过单因素实验和响应面分析，从发酵产酶条件和转化条件两方面，对链霉菌RW-2生物转化

6、葫浙江工业大学药学院2014年硕士学位论文芦素B葡萄糖苷的工艺进行了优化，确定最佳工艺为：产酶培养基组成：土豆200g／L，蔗糖30g／L，大豆粉15g／L；培养基初始pH7．2；培养温度28℃，振荡转速180r／rain，培养时间4d；转化条件为：8mL经2倍稀释的粗酶液、1mL底物溶液和1mL500mM的MnS04溶液组成10mL的转化体系，在温度32℃、振荡转速180r／rain的条件下转化16h。此条件下葫芦素B摩尔产率达到了99．5％，较优化前的17．2％提高了82．3％，总葫芦素中葫芦素B的浓度从1．80g／L提高到3．23g／L，提高了79

7、．4％。最后，采用MCICHP20P柱色谱分离纯化葫芦素B，用乙醇．水梯度洗脱，洗脱曲线表明葫芦素B主要集中在60％乙醇的洗脱液中，收集此段洗脱液，浓缩干燥后即得产物葫芦素B，收率78．5％，纯度98．4％。并通过LC．MS，1H．NMR鉴定产物结构，证实分离产物为葫芦素B。关键词：葫芦素B，葫芦素B葡萄糖苷，微生物转化，链霉菌浙江工业大学药学院2014年硕士学位论文ABSTRACTCucurbitacinsBwithabroadrangeofbioactivity,suchasanti—tumor,anti—hepaticlesion，anti-che

8、mocarcinogenesis，immunityenhancing，hasbe