大鼠嗅上皮神经干细胞体外诱导分化为毛细胞的实验研究

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1、第二军医大学硕士学位论文大鼠嗅上皮神经干细胞体外诱导分化为毛细胞的实验研究姓名：徐亚平申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：范静平201205大鼠嗅上皮神经干细胞体外诱导分化为毛细胞的实验研究目的摘要通过体外原代及传代培养大鼠嗅上皮神经干细胞，优化体外培养条件，并获得具有多分化潜能的神经干细胞球，观察嗅上皮神经干细胞体外增殖特点，将嗅上皮神经干细胞与体外培养的毛细胞或耳蜗培养液共培养的方式诱导分化为耳蜗毛细胞，探索嗅上皮神经干细胞治疗感音神经性耳聋提供基础实验依据及可行性。刀活1、大鼠嗅上皮神经干细胞体外原代、传代培养及鉴定原代培养：雄性250．3009健康大鼠1．2只，C02

2、窒息死亡，断头后取双侧鼻甲及筛板，将鼻粘膜玻璃放入培养皿中，将嗅黏膜组织块用中性蛋白酶消化后，显微镊将嗅黏膜上皮层与固有层分离开，巴尔德斯管将上皮层轻轻吹打，固有层用胶原酶消化后，将上皮层与固有层混合后，轻轻吹打，1000r／s离心10min后，用含10％FBS的DMEM／F12培养液重悬，于培养皿中贴壁培养，2．3天换一次液。传代培养：含10％FBS的DMEM／F12培养液原代培养8．12天后，将贴壁细胞用胰酶消化成单细胞悬液，以细胞密度为5x104个／cm2种植于己用PLL包被的培养皿中贴壁培养，培养液换为无血清促增殖培养液：DMEM／F12、l％ITS、20ng／mlbFGF、4

3、0ng／mlEGF、青霉素一链霉素。每2．3天换液一次。纯化：含10％FBS的DMEM／F12培养液重悬时，培养皿不需要任何物质包被，避免杂细胞混合在一起贴壁。间接免疫细胞化学：嗅黏膜基底细胞(嗅神经干细胞)分为球状基底细胞(GBCs)和水平状基底细胞(HBCs)，间接免疫细胞化学荧光染色方法用抗体GBC．2标记球状基底细胞(GBCs)，用抗体cytokeratin5标记水平状基底细胞(HBCs)。将传代形成神经球从贴壁状态胰酶消化成悬浮状态，后将悬浮球贴壁于另一PLL包被的培养皿中，用含10％FBS的DMEM／F12培养一周，TUJl、S100、GFAP和P75标记嗅上皮神经球分化来

4、的细胞。2、耳蜗细胞培养及与嗅上皮神经干细胞共培养与鉴定耳蜗细胞培养：按照嗅上皮神经干细胞培养方法：取材．组织消化．贴壁培养；培养液为：DMEM／F12、2％B27、青霉素．链霉素，每两天换液一次。第二军医大学硕士学位论文耳蜗组织培养液收集：取新生大鼠取出听上皮基底膜，采用组织培养法，培养液为：含有青霉素．链霉素的DMEM／F12；每天换液，并收集条件培液(CM)，滤器过滤后保存于．80℃备用。嗅神经干细胞与耳蜗细胞共培养：细胞复苏或传代培养后所得单细胞悬液于PLL包被的玻片上贴壁，耳蜗细胞同样贴壁于玻片上，将有嗅神经干细胞及毛细胞的玻片置于同一培养皿中培养，培养液为：含有青霉素．链霉

5、素的DMEM／F12。每两天换液一次，培养20天后，间接免疫细胞化学荧光染色鉴定。或者贴壁的嗅上皮神经干细胞加入CM培养液，每天换液一次，培养20天后，间接免疫细胞化学荧光染色鉴定。圣士里拿日7卜l、大鼠嗅上皮神经干细胞体外原代、传代培养及鉴定原代培养时种植后1天，只有少量细胞贴壁，大部分细胞都悬浮，含10％FBS的DMEM／F12培养8．12天，细胞长满整个培养皿，传代培养液(DFl2+1％ITS+20ng／mlbFGF+40ng／mlEGF)贴壁培养lO一14天后，细胞开始出现增殖，形成增殖球。传代培养细胞贴壁培养l周后能形成增殖球。原代培养1天后，少量贴壁细胞cytokerati

6、n5阳性，原代培养3天后贴壁细胞增殖形成细胞集落，集落中细胞形态大小不一，有的呈圆形，有的呈梭形，还可见不规则含突起细胞，集落周边细胞向四周迁移。对原代贴壁培养3天细胞染色，显示集落靠中央处细胞呈cytokeratin5阳性、GBC．2阳性，集落周边细胞只呈GBC．2阳性。8天后几乎所有细胞呈GBC．2阳性，细胞形态呈长梭形，并可见细胞融合。增殖球重贴壁2天后可见有细胞从球边缘向四周迁移，1周后细胞许多细胞已完全迁出增殖球，呈长梭形。这些细胞可有TU儿、S100、GFAP和P75阳性，这说明体外培养的嗅上皮神经干细胞具有分化多潜能性。2、大鼠嗅上皮神经干细胞体外增殖特点原代贴壁培养增殖

7、的细胞为HBCs，组织来源的GBCs细胞体外培养不增殖，由HBCs分化而来的GBCs可在含lO％FBS培养液中快速增殖，而HBCs能在无血清促增殖培养基中保持增殖状态不趋于分化。在含血清培养基快速增殖的GBCs传代后，以适宜密度种植于培养皿中贴壁培养，传代培养液中培养4天后细胞开始聚集，聚集的中心位置开始形成增殖球，并逐渐增大，增殖球中含有cytokeratin5阳性的HBCs。3、耳蜗细胞培养及与嗅上皮神经干细胞共培养与鉴定耳蜗细胞培养：原代