大鼠肝脏线粒体极长链乙酰辅酶a脱氢酶的表达、纯化与g441突变的鉴定

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1、．MastersDegreeThesis—————————、—————————————————————．———————．———————————摘要————．缺乏症的突变位点有80多个，基园表型各不相同。且仅有少数突变位点得到了研究。tt氪酸-441(Glycine，Gly，G)是在人类、动物、细菌中均存在的VLCAD蛋白氨基酸。在人类的VLCAD缺乏症中，G441D突变被称为致病的突变，其表型为新生儿型和肌肉型。然而对这个突变尚没有分子和功能的研究。综上所述·在本实验中我们利用原核细菌表达系统来表达VLC^JD蛋白和其G441突变点，为研究G4

2、4I突变点对VLCAD蛋白的结构和功能影响奠定基础．并为VLCAD缺乏的新治疗提供理论依据。二、实验方法1．PCR扩增以大鼠肝脏线粒体cDNA作为野生型(Wildtype，WT)VLCAD蛋白的模板，设计VLCAD引物如下：Forward5’。gcgcggatccaggaatlt=aaaatgagaggarcgeateaccateac舻cag馆8ggec越teaggca群t时gga3’，其中含BamHI(GGATCC)酶切位点和CATCACCATCACCATCAC为六个组氨酸标签，Reverse5。etgeaga静act蚀gactctaaggg

3、ggnactggtgaccag3’．其中古Scal(AGTACT)酶切位点。2．鉴定PCR产物3．产物回收回收阳性PCR产物，回收后的PCR产物和pLMl载体进行Scal和BamHI双酶切。4连接载体和目的片段将连接成VLCAD：：pLMl。使用Scal酶和BarnHI酶进行单酶切和取酶切来鉴定已连接的VLCAD；；pLMl。5转化阳性的VLCAD：：pLMI转化到TO?IO感受态细胞，并克隆筛选。阳性克隆在EeolistrainBL21(DES)进行表达转化。经过蛋白质条件表达并电泳后，可确定最佳的IPTG浓度及温度为0．5raMIPTG，室

4、温。6纯化大规模表达蛋白质并纯化。使用HitrapChelatingHP(ImI)柱纯化蛋白。首先按照平衡Hitrap柱用5mr水洗，然后均匀打入5mlNiS04．可看到柱子变成蓝色。水洗去未结台的Ni'，然后用5-7mlStartBuffer平衡柱子。将粗蛋白均匀打入柱内后，用5mlWashingBuffer洗蛋白。此时不含有六个组氨酸标签的蛋白质因为结台能力不强，即随着WashingBuffer洗下，收集第二管Master7sDegreeThesis的样品用于分析蛋白质的表达情况。然后用ElufionBuffer洗蛋白。纯化出来的样品可用于

5、下面的分析。7设计定点突变G441D引物：Forward5’GAT从TGGGGGGCATGGATTTCATGAAGGAAGCAG3’Reversej’CrGGTTCCTTCATGAAATCCATGCCCccc^T似Tc3’G441A引物：Foward5’GATA^TGGGGGGCA础GTTCATGAAGGAACCAG3’Reverse5’CTGGTTCCTTCATGAACGCCATGCCCCCCATTATC3’经过PCR反应，转化后挑选克隆子，进行DNA铡序。经过测序比对，突变正确的克隆按照上述方法提取质粒，然后转化表达蛋白．表达条件、纯化方法

6、、测试方法同wT蛋白。8蛋白测试分析通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白的分子量和纯度。使用紫外可见(URravioletvisiMe+UV-Vis)光谱扫描仪测试wT蛋白丑突变蛋白对cmc】6、c¨、CmCs的活性。使用Bradford方法进行蛋白定量分析。三、结果1．VLCAD蛋白基因的克隆通过PCR打增得到了VLCAD蛋白PCR产物，显示为约】8KB基因长度。2．连接反应及阳性克隆的筛选PCR产物与pLMl载体连接成VLCAD：：pLMl，并使用Scal和BamHl进行单、双酶切。单酶切显示约57KB，双酶切显示分别约为3．gKB和18KB。由

7、电泳结果可知，连接反应与阳性克隆的筛选成功。3vLCAD蛋白分析将收集到的样品甩SDS．PAGE分析虽自质纯化的情况。其挣子量约为665Y-“Da。以上结集表瞒VLCAD蛋白表选正确，丑纯度高。4分子模拟VLCAD蛋白4．1VLCAD蛋白序列的同源比对使用ClustalW软件对来源不同的VLCAD蛋白序列进行同源比对，根据比对的结果可知，G441为高度保守的氢摹酸。42VLCAD蛋白分子模型图使用DiscoveryStudio31

8、软件对VLCAD蛋白分子模型图进行模拟。可模拟出VLCAD蛋白关键位点氨基酸参加与黄桑腺嘌岭二核苷酸(Flavin

9、AdenineDirmcleofide．FAD)辅因子的三维结构图。Glu-462．Trp．249．Thr-217，Ser-223．Master_§D