小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定

《小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验二小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定实验目的掌握RNA操作注意事项了解鉴定RNA含量和质量的方法了解RNA抽提原理熟悉RNA抽提方法实验原理理论基础：真核生物结构基因有内含子基因在转录水平的表达实验原理：四步骤组织或细胞匀浆分离总RNA纯化RNA检测RNA的纯度及完整性理论基础真核生物中绝大多数基因有内含子，如直接由基因组克隆目的基因，不利于编码基因的序列分析及体外利用原核细胞表达。提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主要手段。检测基因在转录水平的表达，需检测

2、mRNA含量，定量RT-PCR是主要方法之一。内含子外显子实验原理抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质，常用酸性酚法。在酸性条件下苯酚可溶解DNA而不溶解RNA，同时酚又是蛋白变性剂。利用酸性酚试剂加氯仿共抽提，可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离。最后利用异丙醇沉淀，即可获得纯化的总RNA。RNA产物的鉴定RNA的纯度与含量用紫外分光光度法检验。高纯度RNA的A260/A280应处于1.6至1.8之间，A260与RNA浓度呈正比，1OD=40μg/mlRNA。RNA的完整性可通过电泳

3、检测RNA为单链分子，二级结构复杂，需先经甲酰胺变性，再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。细胞总RNA以rRNA含量最高，电泳时可观察到18S与28SrRNA两条清晰条带，且亮度之比接近1:2，表明RNA没有发生降解。泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带，主要由5S、5.8SrRNA与tRNA组成。RNA电泳结果示意图28S18S5SRNA电泳结果凝胶成像图28S18S5S取小鼠肝组织匀浆处死小鼠匀浆取肝50~100gTrizol1ml匀浆RNA纯化操作步骤加入氯仿0.2ml，剧烈振荡，室温

4、放置10分钟。12000rpm离心15min，取上清。（离心后溶液分为三相，即上层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白。小心吸取上层水相，绝不能有中层蛋白混入。）加入异丙醇0.5ml，振荡混匀，室温放置10分钟，12000rpm离心10min，弃上清。（加入50％的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当。）1ml75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，重复一次。空气干燥沉淀，溶解于20μlDEPC-H2O。留样2μl，其余－70℃保存备用。RNA电泳操作步骤制备琼脂

5、糖凝胶：首先将0.5g琼脂糖溶化于32ml水，冷却至60℃。加入5×甲醛变性凝胶电泳缓冲液10ml，37％甲醛水溶液9ml，混合均匀并灌制胶板。取1μlRNA溶液，加入甲酰胺-上样缓冲液9μl，95℃变性5分钟，迅速冰浴冷却。点样。150V电泳30分钟，紫外灯下观察电泳结果。分光光度法操作步骤加1μlRNA溶液于0.4mlDEPC-H2O，充分混匀，读取260nm与280nm的吸光度数值。操作注意事项（一）因为RNA酶分布广、活性强、且难以失活，使RNA极易降解，操作时应特别注意：高压消毒实验器

6、皿，烤干。以0.1%DEPC过夜处理所有试剂配置用水，并高压消毒。抽提RNA时，应戴手套和口罩，少说话。操作注意事项（二）DEPC是强烈的烷化剂，通过与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶活性，是消除外源性RNA酶的主要方法。但CEPC有致癌作用，并具有很强的反应性，因此注意：使用时，不直接接触DEPC处理的器皿和水必须经高压灭菌处理，使DEPC分解后使用。操作注意事项（三）为避免酶蛋白反复冻溶而失去活性，酶制剂溶于50％的甘油中，-20oC储存可保持液状。但高浓度的甘油对酶促反应

7、有抑制作用，因此酶的用量不能超过反应体积的1/10。在进行各种酶促反应时，应首先加水，再加入其它成分，最后加酶。