DNA、RNA的提取、纯化与鉴定

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1、DNA/RNA的提取、纯化与鉴定编辑词条发表评论（0）目录DNA的提取纯化基因组DNA的提取从植物组织提取基因组DNA从动物组织捉•取基因组DNA细菌基因组DNA的制备基因组DNA的检测组织DNA的提取和纯化石蜡包埋组织的DNA提取及其应用外周血DNA提取技术真核细胞DNA的制备植物组织中DNA的提取细菌DNA的提取方法真菌DNA提取总结的两种方法组织mRNA提取操作步骤RNA酶活性的控制用杲硫氤酸弧和有机溶剂提取RNAmRNA的分离哺乳动物细胞总RNA的分离植物总RNA的分离植物mRNA的分离PCR常

2、见问题分析琼脂糖凝胶DNA回收常见问题分析RNA提取常见问题分析DNA电泳常见问题分析质粒提収帘见问题分析凝胶电泳操作注意事项实验：DNA片段的回收及纯化实验：RNA的提取及其纯度检测［显示部分］DNA的提取纯化编辑木段冋目录一、细菌培养物的牛长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（冇含冇行当抗生索的液体培养慕中生长），然后从中纯化质粒，质粒的捉纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时

3、，不必造反性地扩增质粒DNAo然而，较长一代的载体（如pBR322）由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉索继续培养若十小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像PBR322-类的质粒，从经氯霉索处理和未经处理的培养物屮捉取质粒的产量迥然不同，前者人为增高。多年來，加入足以完全抑制蛋口质合成的氯霉素（pg/ml）Q成为标准的操作、用该方法提収的质粒DNA量，对于

4、分子克隆中儿乎所有想象到的工作任务。二、细菌的收获和裂解细菌的收获口J通过离心來进行，而细菌的裂解则町以采川多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法収决于3个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出楮确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。1、大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然

5、后川溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS-•类去污剂溶解球形体。这种方法最人限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需耍的作用力。2、可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，冇时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全大然的超螺旋分子。3、一些大肠杆菌菌株（如HB101的一

6、些变种衍生株）用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化锥一溟化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌菌株11•大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。4、当从表达内切核酸酚A的大肠杆菌菌株（endA+株，如HB101）中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A,以后在温育（如用限制酶消化）时，质粒

7、DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽捉）可以避免此问题。5、忖前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不盂要用氯霉索进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿川氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大虽制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数屮期在增减物屮加入氯霉索可以避免这种现象。有氯霉索存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素吋从较大量细胞所得到的质粒DNA的量人致相等。三、质粒DNA的纯化常使用的所有纯化方

8、法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合坏状这样两个性质。例如，用氯化钠一漠化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA就取决于漠化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。浪化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA屮引入超螺旋单位。最示，超螺旋度人为增加，从而阻止了漠化乙锭分了的继续嵌入。但线状分了不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和（每2个碱棊