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1、第四章 基因工程的主要技术及其原理第一节DNA和RNA的提取与纯化制备纯的高分子量的DNA是基因工程操作的基础之一一、DNA提取的基本原理与方法化学性质比较稳定潜在的反应基团隐藏在中央螺旋内，并经氢键紧密连接。它的碱基对外侧受磷酸和糖形成的强大环层的保护，这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强。1.DNA的性质：核苷核苷酸碱基高分子质量DNA长而弯曲，仅具有极微的侧向稳定性，因而容易受到最柔和的流体剪切力的伤害。双链DNA在溶液中随机卷曲，并由于碱基堆积力和DNA骨架上磷酸基团间的静电排斥力而变得黏滞。由吸液
2、，振荡，搅拌所导致的水流对黏滞的盘绕物产生拖拉力，能切断DNA的双链。DNA分子越长，断裂所需的力越弱。因此，基因组DNA容易成片段地获得，所需分子质量越大，获得的难度也相应增加。物理性质2.天然DNA的来源和用途天然DNA包括染色体DNA,病毒DNA(噬菌体DNA),质粒DNA,线粒体及叶绿体DNA等,可从不同的生物体中提取.染色体DNA.原核和真核生物均含有染色体DNA.其分子巨大,可长达106kb,小的也有1000kb左右.是生物界含量最丰富的DNA资源,蕴藏着地球上极大部分的遗传信息.是分离目的基因和
3、基因表达调控因子的主要材料,也可提供构建染色体载体和染色体基因整合平台系统之用.病毒和噬菌体DNA.含DNA的病毒和噬菌体的种类很多,能在相应的原核生物和真核生物宿主细胞内大量增殖.由于此类DNA可被体外包装,所以主要用于构建基因克隆载体,承载较大片段的外源DNA,经体外包装,导入受体细胞.此类DNA也编码一些结构基因,可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料.质粒DNA很多微生物细胞内含有质粒DNA,游离于细胞质中,所以被称为染色体外遗传物质.每种质粒都有复制起始位点,能自我复制.主要用于构建载体.也要用
4、于分离目的基因和基因表达调控因子.线粒体和叶绿体DNA.真核生物特有的染色体外遗传物质,分别含有与呼吸作用和光合作用有关的基因.可用于分离目的基因及构建载体不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。（一）DNA提取的基本原理DNA分子是极性分子，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，其钠盐比游离太更易溶于水。酸性溶液中，DN
5、A易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。生物细胞中大部分DNA集中在细胞核，多以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。而DNP在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度的显著影响，0.14mol/LNaCl溶液中最低，仅为水中溶解度的1%，浓度升高，溶解度增加，到1mol/L时，比纯水高2倍。而核糖核蛋白(RNP)在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/LNaCl的溶解度较大。据此，可分享DNP和RNP.一般DNA提取都分为两步，即先是温和或机制裂解细胞及溶解DNA，接着采用几种化学和酶学方法中的任一种，以去除
6、蛋白、RNA及其它的大分子。1生物材料的准备选用的材料应该是处于提取DNA得率最高的生长期,或者是DNA容易提取和含量高的组织.对于细菌,一般取对数生长后期.对于植物一般取幼嫩的植株,并且暗培养1-2天,甚至黄化苗.提取动物肝脏DNA应清除胆囊,因其含有多种高活性酶.2细胞的裂解和DNA的溶解细胞不裂解,则DNA释放不出来.裂解不完全,得率就低.如果细胞裂解过于激烈,会导致DNA的断裂.裂解方法因物种而异.对于原核生物,可用溶菌酶处理.用NaOH,SDS,用煮沸及冰冻,超声波处理等方法使细胞裂解.对结构复杂的
7、动植物材料要进行磨样(粉碎)。一般方法是将材料放入研钵（放在冰中预冷），加入液氮，快速磨碎成粉状。然后再参照裂解原核生物细胞的方法裂解细胞.一般用SDS、CTAB、溶菌酶和蛋白酶K来裂解细胞。所用缓冲液一般为TE（TrisC-HClEDTA）缓冲液。提取缓冲液：100mmol/LTrisCl(pH8.0),50mmol/LEDTA(pH8.0),500mmol/LNaCl,10mmol/Lα巯基乙醇。在提取时，将10％SDS加入缓冲液中于65℃预热一定时间。然后加入到装有样品的离心管中，于65℃保温60－90
8、min。其间轻轻摇动数次。4℃下12000rpm离心10min,将上清转入另一离心管中,上清即为DNA的粗提物。正常条件下，由于细胞的区室化隔离，DNA酶，氧化酶等分布于特定区隔中，不与DNA接触。细胞破碎，则容易导致DAN降解。因此提取过程中对DNA的保护显得非常重要。措施：（１）利用液氮超低温下研磨，减少损失。（２）快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。加入EDTA和抗氧化剂及P
