dna和rna提取原理和方法

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1、核酸提取及常见问题分析主讲人：刘召华唐维（修改）第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。前言第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原

2、因分析及其对策第一部分：DNA提取方法简介DNA提取的几种方法基因组DNA的提取CTAB法SDS法其它DNA提取的几种方法非基因组DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法基因组DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条

3、件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.

4、0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA－CTAB法褐变CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PV

5、P（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA－CTAB法PVP（聚乙烯吡咯烷酮）PVP按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的

6、结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－CTAB法SDS法原理基因组DNA－SDS法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清

7、液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取缓冲液2.65水浴60min,其间缓慢摇动几次。3.加入150ul的5mol/LKac,混匀,冰浴15min左右SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法基因组DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫

8、氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法根据细胞裂解方式的不同有：基因组DNA－其它方法吸附材料结合法：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料阴离子交换树脂磁珠高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。基因组DNA－其它方法浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利