资源描述：
《小鼠肝脏RNA的提取纯化与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、小鼠肝脏RNA的提取纯化与鉴定分子生物学实验报告一、实验时间：2011年11月21日10:00—17:30三、实验冃的：了解总RNA提取的基本原理、应用及操作的注意事项，熟悉掌握组织中总RNA提収方法及其检测方法。四、实验原理：在真核生物，由于绝大多数基因含有内含子，因此不能直接由基因组克隆目的基因，提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主耍手段，此外，在利用Northern印迹杂交等技术分析基因表达水平时也需要提取RNA。本实验要求自小鼠肝脏提取RNA,并通过甲醛变性琼脂糖凝
2、胶电泳进行检测，通过紫外分光光度法进行定量。RNA是极易降解的核酸分子，这主要是因为RNA酶分布广、活性强、且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解。抑制RNA酶活性的方法很多，但均不能彻底避免RNA酶对RNA的降解。焦磷酸二乙酯（DEPC）是一种强烈的烷化剂，它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪卩坐环反应而抑制RNA酶的活性。DEPC是消除外源性RNA酶的主要方法。以O.：L%DEPC处理实验器1111与试剂配制用水，基本可以消除外源RNA酶的污染。但DEPC具有致癌性，在使用时一定要留意。DEP
3、C处理的器皿与水必须经高压灭菌处理，使DEPC分解后方能使用。值得注意的是，DEPC具有很强的反应性，能够与包括RNA在内的多种生物分子以及多种化学试剂作用，因此不能直接用于抑制样品以及试剂中的RNA酶活性。在RNA抽提试剂屮加入异硫氧酸弧，是抑制样品来源RNA酶活性的主要方法。作为一种蛋白变性剂，异硫氧酸弧可导致包括RNA酶在内的所有酶活性的丧失，因此RNA纯化过程中因尽可能去除异硫鼠酸弧，以防止其对酶促反应的影响。在使用蛋白质变性剂的同时，更重耍的是去除样品中的蛋白质，防止内源性RNA酶对样甜RNA的降解。
4、逆转录反应时，反应体系中不能含有烷化剂或变性剂，此时痕量的RNA酶也可能对RNA产生破坏。在这种情况下，最适宜的方法是加入特异性的RNA酶抑制剂。这类RNA酶抑制剂本身是蛋口质，可专一性作用于RNA酶，对RNA的逆转录以及体外翻译等过程均无干扰。抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质，最常用的方法是酸性酚法。苯酚在酸性条件下可溶解DNA而不溶解RNA,同时酚乂是蛋白变性剂。利用酸性酚试剂与氯仿的抽提，可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离。最后利用异丙醇沉淀，即可获得纯化的总RNA。RNA产物的定量与纯度
5、检测一般是通过紫外分光光度法。高纯度的RNA其A260/A280应处于1.6至1.8之间，A260与RNA浓度呈正相关。RNA的完整性可通过电泳检测。由于RNA为单链分子，二级结构复杂，必须首先利用甲醛胺变性RNA,再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。细胞总RNA包含了三种主要组分，其中rRNA含量最高，因此在电泳时可观察到18S和28SrRNA的条带。如两条条带清晰，且亮度Z比接近1:2,则表明RNA没有发牛降解。一般情况下泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带，主要由5S、5.8SrRNA与tRNA组成。
6、如果RNA严重降解，则此条带亮度会明显增强，mRNA由于含量较少且长度不均一，一般观察不到相应的条带。本实验的要求是采用酸性酚法自小鼠肝组织抽提RNA,通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，即经电泳因观察到18S与28SrRNA的清晰条带，最后通过紫外分光光度法对RNA进行定量与纯度检验，计算RNA产物的浓度与含量。五、主要实验试剂与仪器：1、TissueRuptor,购自QIAGEN。2、塑料器皿，应用0.1%DEPC浸泡12h,121°C高压灭菌15min,干燥即可使用。3、无RNA酶水：用去离子水
7、配制0.1%的DEPC,购自SAGON,37°C保温12h,121°C高压灭菌15mino4、Trizol试剂：酸性酚试剂，购自Takara公司。5、氯仿6、异丙醇7、75%乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司。8、5X甲醛变性电泳缓冲液：MOPSO.IM(pH7.0),乙酸钠40mM,EDTA5mM(pH8.0)。9、RNA电泳用加样缓冲液:50%甘油，ImMEDTA(pH8.0),0.25%漠酚蓝。六、实验方法与步骤：(%1)RNA的抽提1.引颈处死小鼠，迅速取出肝组织约50-100mg于匀浆管，加入Triz
8、ol试剂lml,充分匀浆，室温放置10分钟。2.12000rpm离心lOmin,取上清。3.加入氯仿0.2ml,剧烈震荡15s,4°C放置10min?12000rpm离心15min,取上清。氯仿的主耍作用是将酚从溶液中萃取出来。离心后溶液分为三相,即上层的水相，下层的有机相以及中间的变性蛋白，小心吸取上层水相,绝不能有中层蛋白混入。4.加入异丙醇0.5ml,震荡混匀，4°C放置lOmi
