rna的抽提与鉴定

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1、RNA的抽提与鉴定背景核糖核酸（RiboNucleicAcid,简称RNA）是由至少几十个核糖核背酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名，简称RNAo遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）是対中心法则的补充。三种常见的RNA1-mRNA信使RNA功能：蛋白质合成的直接模板2.tRNA转运RNA功能：氨基酸的运载体3.

2、rRNA核糖体RNA功能：核糖体的组成成分，蛋白质的合成场所其他小分子RNA1.hnRNA核内不均一RNA成熟mRNA的前提2.snRNA核内小RNA参与hnRNA的剪接与转运3.snoRNA核仁小RNArRNA的加工与修饰4.SCRNA/7SL-RNA胞质小RNA蛋白质内置为定位合成信号识别体组成成分5.siRNA小的干扰RNAsiRNA在RNA沉寂通道屮起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素实验原理细胞中的RNA可分为信使RNA,转运RNA和核糖体RNA三类，这三种类型的RNA都存在于细胞质中，所以从不同组织屮提取的总RNA的本质就是细胞的裂解，RNA

3、的释放，通过不同的方式去除蛋白质，DNA等杂质，最终获得高纯度的RNA产品工艺。实验目的1完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、CDNA合成及体外翻译等的前提。2临床诊断屮的应用：病毒检测等RNA提取的方法及步骤1提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来。（该方法将导致小分子量RNA的丢失，冃前该方法的使用频率已很低。）2在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相，而达到分离RNA的目的。根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下两种制备方法：1弧盐法：异硫氤酸弧和硫氤酸肌2LiCI/尿

4、素法以肌盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。Trizol（异硫氤酸肌•苯酚法）1由苯酚和硫氤酸肌等配制而成的单相的快速抽提试剂；2可在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性；3在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA；4Trizol可以从最少100个细胞或lmg组织屮提取RNA。如果细胞量过少或组织来源特异,可以采用相应试剂盒提取RNAoTrizol法的原理1异硫氤酸，卜筑基乙醇，SDS裂解细胞2酸性条件（pH4.0）下酚、氯仿抽提，离心,蛋白质

5、，DNA和脂质进入有机相，而RNA存在于水相3界丙醇沉淀水相中的RNATrizol法提取RNA操作步骤1.剪碎的鼠肝中加入Trizol试剂，进行机械匀浆，取lmlTrizol匀浆液于1.5ml离心管内，室温放置5分钟，以充分裂解细胞。目的：变性剂充分作用裂解细胞，释放核酸。2.每管加入200ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min；注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。3.4°C12,000rpm离心15min；4.吸取上层水相，至另一离心管中；注：不要吸取中间界面。目的：分离RNA、DNA、蛋白质等。5.加入0.5ml异丙醇混匀，室温放置5-10min；6.4°C12,00

6、0g离心lOmin,弃上清，RNA沉于管底；目的：沉淀RNA。异丙醇会夺取大量RNA分子间的水分子，因此RNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。7.按lml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。（此时可放-70°C保存）目的：洗涤RNA,去除残余的盐类等杂质。8.4°ClOOOOrpm离心5min,尽量弃上清。9.短暂离心收集管壁液体并吸弃。室温晾干2-3min0注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。10.用200ul（体积可根据RNA的沉淀量具体调整）DEPC处理的H20溶解RNA样品，溶解后立即置于冰上。注：H2O>TE或0・5%SDS均

7、须用DEPC处理并高压。简易TBE电泳观察RNA的完整度1制胶：琼脂糖凝胶粉（0.7%）,消毒TBE缓冲液，Goldview显色剂2上样：20ul样品（含上样缓冲液）混匀后,加入凝胶孔中；上样缓冲液（loadingBuffer）:漠酚蓝、二甲苯青FF、蔗糖，甘油3电泳：电泳110V,15mino4紫外灯下观察RNA质量及纯度的分析方法一、检测RNA溶液的吸光度260、320、230、280nm的吸光度分別代表核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质的水平；纯的RNA,230：260：280=