大鼠肝脏线粒体极长链乙酰辅酶a脱氢酶表达、纯化及g441突变鉴定

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1、原创性声明IIIIIMIIIIIIMIIIIIIIIIIIIIIIIJlllY2198404本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：．垒过蝗学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文

2、被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：垒婆蝗导师签名到监日期：兰旦!墨年三月翌日Master’sDegreeThesis摘要一、前言线粒体脂肪酸D．氧化是心脏和骨骼肌代谢过程中的主要能量来源，尤其是肝脏线粒体D．氧化产生的酮体，在运动、禁食或饥饿状态下对机体供能发挥重要作用。乙酰辅酶A脱氢酶(Acyl．CoAdehydrogenases，ACADs)是线粒体黄素酶，它有11

3、个亚型，其中短链乙酰辅酶A脱氢酶、中链乙酰辅酶A脱氢酶、长链乙酰辅酶A脱氢酶、极长链乙酰辅酶A脱氢酶和乙酰辅酶A脱氢酶9是线粒体p。氧化催化各种长度的直链脂肪酸的第一步反应的重要的酶。而这五种ACADs的分子量，结构和分布不同，各有特性。极长链乙酰辅酶A脱氢酶(Very—long—chainacyl-CoAdehydrogenase，VLCAD)和ACAD一9均为同源二聚体，其分子量约为66．5kDa，其余的三种ACADs则为同源四聚体结构，分子量为43—45kDa。VLCAD在线粒体内膜结合，不易提取，需加入清托剂溶膜方能被分离，而其他3种AC

4、ADs分布于线粒体基质中，无需溶解，易被提取。VLCAD是ACADs家族中的重要一员，它是线粒体B一氧化中催化长链脂肪酸第一步反应中的关键酶。棕榈酰辅酶A(C16)和硬脂酰辅酶A(C18)是植物和动物组织中最丰富的脂肪酸化合物，主要由VLCAD进行催化。研究表明，VLCAD对C16的活性是LCAD的10倍。VLCAD缺乏会导致脂肪酸p．氧化障碍，C16水平明显升高，从而对心脏、肌肉、肝脏产生严重不良影响。与其它B．氧化紊乱比较，VLCAD缺乏症均有早期发病、临床表现形式不一、临床症状严重、死亡率高(75％于发病2个月内死亡)等特点，且大多数VLC

5、AD缺乏患者均有不同程度心功能和肝功能异常。目前使用串联质谱法来检测疑似病例中血浆酰基肉碱的表征，并通过分析研究成纤维细胞或淋巴细胞的脂肪酸氧化和／或VLCAD的基因序列可以确诊VLCAD缺乏。尽管在欧美等国VLCAD缺乏已成为新生儿疾病常规筛查的一部分，但由于症状的多样性及需要在适当的时间收集血液和尿液标本进行相关的代谢调查，仍然有大量的VLCAD缺乏症被漏诊。同时，利用目前的手段仅能判断患者是否存在VLCAD缺乏却不能评估VLCAD缺乏的程度。目前尚无确切的治疗VLCAD缺乏症的方法，主要是避免禁食，增加高碳水化合物和中链甘油三酯的摄入，减少

6、长链脂肪饮食。尽管有很多学者对脂肪酸B．氧化和VLCAD缺乏进行了大量研究，但其分子机制仍不明确，从而阻碍了疾病的诊断和合理治疗。迄今为止已知的VLCADMaster’sDegreeThesis摘要缺乏症的突变位点有80多个，基因表型各不相同。且仅有少数突变位点得到了研究。甘氨酸一441(Glycine，Gly，G)是在人类、动物、细菌中均存在的VLCAD蛋白氨基酸。在人类的VLCAD缺乏症中，G441D突变被称为致病的突变，其表型为新生儿型和肌肉型。然而对这个突变尚没有分子和功能的研究。综上所述，在本实验中我们利用原核细菌表达系统来表达VLCA

7、D蛋白和其G441突变点，为研究G441突变点对VLCAD蛋白的结构和功能影响奠定基础，并为VLCAD缺乏的新治疗提供理论依据。二、实验方法1．PCR扩增以大鼠肝脏线粒体cDNA作为野生型(Wildtype，WT)VLCAD蛋白的模板，设计VLCAD引物如下：Forward5’cgcgcggatccaggaarttaaaatgagaggarcgcatcaccatcaetateacgccagtgaggccacteaggcagttotgga3’，其中含BamHI(GGATCC)酶切位点和CATCACCATCACCATCAC为六个组氨酸标签。Rever

8、se5’etgtagagtactttagactctaagggggttactg酉gaccag3’，其中含ScaI(AGTACT)酶切位点。