诱导小鼠esips细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究

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1、上海交通大学医学院2009级博士论文上海交通大学医学科学博士学位论文论文题目：诱导小鼠ES/iPS细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究院（系、所）：上海交通大学医学院学科（专业）：眼科学研究生：陈苹学号：0097239212指导教师：范先群教授论文答辩日期：2012年10月万方数据上海交通大学医学院2009级博士论文诱导小鼠ES/iPS细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究ApreliminarystudyoninductionofmouseES/iPScellsdifferentiationtocornealendotheliumexvivo院（系、所）：

2、上海交通大学医学院培养单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院学科（专业）：眼科学研究方向：眼表疾病及组织工程角膜构建申请学位：博士研究生：陈苹指导教师：范先群教授论文答辩日期：2012年10月基金赞助：国家自然基金（No.31000443）；关键词：ES细胞，iPS细胞，组织工程，共培养，诱导分化，角膜内皮重建万方数据上海交通大学医学院2009级博士论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成

3、果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日万方数据上海交通大学医学院2009级博士论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□√，在5年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在

4、以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日万方数据上海交通大学医学院2009级博士论文诱导小鼠ES/iPS细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究摘要目的：通过在体外分阶段的序贯诱导途径，探索小鼠胚胎干细胞(ES)及诱导型多潜能干细胞(iPS)向角膜内皮样细胞定向分化的潜能，探究化学分子RA，细胞因子(bFGF、BMP4)联合体细胞共培养诱导的具体条件和方案，以期阐明其定向分化中的关键机制，并验证ES和iPS细胞作为角膜组织工程种子细胞的可行性，为组织工程角膜内皮层重建寻找来源充足，安全可靠的新型种子细胞奠定基础。方法：1

5、.体外撕膜法分离消化新西兰大白兔的角膜内皮细胞及晶状体上皮细胞，建立培养扩增体系，并对其活力和特异性表达的标志物进行免疫荧光细胞化学（ICC）鉴定。收集晶状体上皮细胞的条件培养液，采用MTT法、Ki67的免疫荧光检测角膜内皮细胞在条件培养液中的增殖能力，用Westernblot评估其表型标记物表达的变化。2.应用mef制备feeder，联合ES培养液维持和扩增小鼠ES细胞及iPS细胞系，并鉴定其全能性指标。去除lif因子及feeder，万方数据上海交通大学医学院2009级博士论文在低黏附培养皿中悬浮培养拟胚体EB,EB形成第四天加入不同浓度RA,并

6、在不同时间点用定量PCR检测神经脊分化的指标。选择和比较不同的细胞外基质包括纤维连接蛋白、层粘蛋白、明胶、多聚赖氨酸和组织液房水作培养板的包被对神经脊（neuralcrest,NC）细胞迁出分化的影响，并采用ICC法对分化标志物进行检测。3.用P2-P3的兔角膜内皮细胞和兔晶状体上皮细胞分别进行如下共培养处理，包括：①条件培养液收集；②微胶囊包裹隔离共培养；③作为transwell小室隔离共培养的细胞；④丝裂霉素C处理制备饲细胞铺层；⑤活性细胞铺层。将初步诱导的NC样细胞序贯进入共培养阶段，比较并确定合适的共培养方法。应用ICC对分化后内皮样细胞进

7、行表面标记关键分子的鉴定，定量PCR对分化后细胞mRNA表达谱的分析。4.采用bFGF+BMP4单层贴壁法诱导ES细胞向神经脊干细胞分化，后续条件培养液诱导向角膜内皮样细胞分化，并用ICC鉴定分化标记物的表达情况，用定量PCR分析基因表达的变化。结果：1.兔角膜内皮细胞、晶状体上皮细胞在体外可以稳定地培养增殖，并表达其组织特异性的标记物。晶状体的条件培养液对角膜内皮细胞的增殖没有明显影响，但能上调角膜内皮细胞中ZO-1,N-cadherin和Vimentin的表达。2.ES/iPS细胞在lif和feeder的培养条件下表达全能性的标记物Oct4，S

8、SEA-1，AP(+)；去除lif和feeder后，在悬浮培养过程中万方数据上海交通大学医学院2009级博士论文形成拟胚体