角膜内皮细胞新的分子标记及人胚胎干细胞向角膜内皮细胞分化的研究——博士论文

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1、博士学位论文角膜内皮细胞新的分子标记及人胚胎干细胞向角膜内皮细胞分化的研究姓名：学号：所在院系：生命科学与技术学院学科门类：理学学科专业：生物化学与分子生物学指导教师：教授年月二〇一二年十二月二〇一二年九月同济大学博士学位论文摘要摘要目的(1)建立人类胎儿和成人角膜内皮细胞（cornealendothelialcells,CEC）mRNA转录组表达谱。比较角膜内皮细胞在胎儿及成人阶段不同的表达模式，找出角膜内皮细胞组织特异性基因表达谱和若干角膜内皮细胞新的分子标记。(2)建立一套有效的的从人胚胎干细胞和可诱导的多能干细胞分化为角膜内皮细胞的方法，为组织工程化角膜

2、内皮细胞治疗角膜内皮损伤提供实验依据。方法(1)提取胎儿及成人角膜内皮细胞RNA，运用RNA-Seq技术建立人类胎儿和成人角膜内皮细胞转录组表达谱。从GEO数据库中收集97个不同样品的RNA-Seq数据，代表其他12种不同组织细胞类型。通过比较基因组学，绘制层次聚类图和三维散点图找出胎儿及成人CEC与其他组织细胞类型的关系。运用生物信息学，找出CEC组织特异性基因表达谱和阶段特异性基因表达谱，用David在线生物信息分析系统对CEC特异性基因列表进行基因本体分析（GeneOntology,GO）和KEGG通路分析。应用免疫组织荧光化学染色对筛选出的若干新的CEC

3、标记分子进行蛋白水平验证。(2)运用人胚胎干细胞（humanembryonicstemcells,hESCs）或可诱导的多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPSCs）作为种子细胞，遵循角膜内皮细胞生长发育规律，将诱导过程分为两个阶段：第一阶段为hESCs或iPSCs向神经嵴细胞（NeuralCrestcells,NCC）分化，该阶段我们尝试了短期诱导法（4天）和长期诱导法（2周），所用的化学因子包括Noggin和小分子化合物SB431542。第二阶段为神经嵴细胞向CEC转化，我们对比应用了添加特定化学因子组合的方法和利用牛角膜内

4、皮细胞条件培养基进行诱导的方法，所添加的化学因子组合包括:转化生长因子-β（Transforminggrowthfactor-beta,TGF-β）,血小板衍生生长因子（Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）和Dickkopf2(DKK2)。诱导期间，通过对各阶段细胞形态学观察，RT-PCR，免疫组织化学染色检测标记分子，建立一套从hESCs或iPSCs向角膜内皮细胞诱导的最佳方法。将此方法得到的CEC样细胞做基因转录表达谱分析，找出和其他组织细胞类型的关系。69同济大学博士学位论文摘要(3)建立牛角膜内皮细胞培养体系，准备去细胞的

5、牛角膜后弹力层作为细胞载体。建立兔角膜后弹力膜机械损伤模型，移植入以牛角膜后弹力膜为载体的牛角膜内皮细胞。通过术后不同时期兔角膜透明度和厚度的恢复程度来判断移植物对于兔角膜机械损伤的修复效果。实验结束，将兔处死后固定角膜组织，通过HE染色判断细胞在受体中存活能力及对角膜结构修复能力的大小。结果(1)通过和12种其他类型的细胞和组织比较，在层次聚类图中我们发现胎儿的角膜内皮细胞表达谱更加接近于一些未成熟的细胞而成人的角膜内皮细胞聚类于一些终末分化的体细胞或组织。通过比较基因组学分析，找出284个成人CEC和245个胎儿CEC组织相关性表达基因。GO分析表明284个

6、成人CEC高表达基因主要参与了其功能相关的无机阴离子跨膜转运活动，转录因子和细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂的活性调控。而245个胎儿CEC特异性基因则主要参与构建细胞外基质结构成分，与血小板衍生因子及其他生长因子结合的活性。进一步比较胎儿及成人CEC阶段特异性基因表达时，分别得到了518个成人和668个胎儿相对高表达基因。GO和KEGG通路分析显示，一些代谢相关的基因在成人CEC中呈相对较高的表达水平，而金属肽酶的活性，细胞外结构调节及TGF-β信号通路则在胎儿CEC中相对活跃。免疫组织荧光化学检测若干标记性分子蛋白表达水平显示胎儿（17-18周）及成人CEC（>

7、37岁）均表达紧密链接蛋白ZO-1，但与CEC泵功能相关的蛋白Na+-K+-ATPase，仅在成人CEC中有表达。参与Wnt信号通路的Axin2和Beta-catenin在胎儿及成人CEC中均被检测到，但Wnt5a只在胎儿CEC中表达。S100蛋白家族的S100A4和S100A6只表达于成人CEC。此外，我们还发现即早反应蛋白IER3在胎儿CEC和成人CEC转录水平上都呈高表达水平，但在细胞中的定位有明显的区别，IER3表达在胎儿CEC细胞核，却表达于成人CEC的细胞质。(2)通过分组诱导，我们发现在hESCs或iPSCs向神经嵴细胞诱导阶段，短期诱导法和长期诱

8、导法都可以获得同时表达神