肝癌干细胞样细胞耐受索拉非尼的分子机制及其对策的研究

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1、第二军医大学硕士学位论文肝癌干细胞样细胞耐受索拉非尼的分子机制及其对策的研究姓名：翟蓓蓓申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：殷正丰201205肝癌干细胞样细胞耐受索拉非尼的分子机制及其对策的研究摘要研究目的研究肝癌干细胞样细胞天然耐受索拉非尼的分子机制，并探索逆转其耐受索拉非尼的可能途径。研究方法应用非粘附性球培养系统富集肝癌干细胞样细胞，进行下列研究：1．MTS法(四唑化合物比色法)检测肝癌干细胞样细胞对索拉非尼天然耐受的情况；2．MTS法筛选能克服肝癌干细胞样细胞对索拉非尼耐受的分子拮抗剂；3．MTS法和Annexin．V—FITC检测MK2206(AKT抑制剂)联合索拉非尼体外

2、杀伤肝癌干细胞样细胞的效应；4．WestemBlot分析肝癌细胞和肝癌干细胞样细胞的AKT和ERK信号通路关键分子的表达情况；5．用肝癌干细胞样细胞建立裸鼠荷瘤模型，评估MK2206联合索拉非尼的体内抑瘤效果；6．免疫组化和TUNEL验证其潜在的抑瘤机制。研究结果1．肝癌干细胞样细胞对索拉非尼存在天然耐受现象。2．MK2206可增强索拉非尼抗肝癌效应。MTS和Annexin．V—FITC检测结果表明，与单药相比，MK2206和索拉非尼联合用药能明显增加细胞死亡率和凋亡率。3．肝癌干细胞样细胞和肝癌细胞的AKT及ERK信号通路的活化水平有差异。从PLC／PRF／5富集的肝癌干细胞样细胞与其

3、配对细胞系相比，AKTThr308(苏氨酸308位点)处于高磷酸化状态，而AKTSer473(丝氨酸473位点)处于低磷酸化状第二军医大学硕士学位论文态。MK2206可抑制AKT这两个位点的磷酸化。在肝癌干细胞样细胞中，pERK表达下调，经索拉非尼以及联合药物处理后可使其表达上调。4．MK2206和索拉非尼对于裸鼠移植瘤的生长具有协同抑制作用。给药14天后，联合用药组、索拉非尼单药组(20mg／kg)、MK2206单药组(20mg／kg)和溶剂对照组肿瘤体积分别为156±105ITll'n3、405±125mm3、947-1-236nllil3和2582+268mm3。5．索拉非尼和MK

4、2206在体内分别抑制ERK和AKT磷酸化，联合用药可增强索拉非尼对ERK磷酸化的抑制作用，并明显降低细胞增殖(Ki67染色)和血管生成(CD34染色)。TUNEL染色检测结果显示，MK2206能明显增加索拉非尼诱导的肿瘤细胞凋亡，移植瘤组织中凋亡细胞从3．4％提高到18．1％(P

5、样细胞耐受索拉非尼的分子机制及其对策的研究AbstractToinvestigatethemolecularmechanismsofintrinsicresistancetosorafenibinhaptomastem—likecells，andlookforthepossiblewaystoovercomeit-MethodsUsingnonadherentspheroidculturesystem，haptomastem-likecellswereenrichedandthefollowingassayswereperformed．1．UsingMTSassaytodetectthe

6、intrinsicresistancetosorafenibinhepatomastem．1ikecells．2．UsingMTSassaytoscreencellsignalingpathwayinhibitorsthatcouldovercometheresistancetosorafenibinhepatomastem-likecells．3．UsingMTSassayandAnnexinV／FITCtoassessthesynergisticeffectofMK2206，AKTinhibitor，combinedwithsorafenibinvitro．4．UsingWester

7、nBlotanalysistodeterminetheexpressionlevelofAKTandERKsignalingpathwaysamonghepatomacellsandhepatomastem-likecellswithorwithoutdrugtreatments．5．EstablishinghepatomaCSCxenograftsmodeltoevaluatetheinvivoeffectsofsorafenib