hiv-1核心抗原p24基因的表达、纯化、鉴定及应用性研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化、鉴定及应用性研究Ex[!ssion、purification、identificati(andpplicati口ofExpressionpuritlcationidenullatlonanoapplicationOI、HIV-1corep24antigen课题来源：广东省“211工程”项目学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院刘华琴王萍副教授董文其教授免疫学学术型硕士生物技术学院2013年5月17日广州硕士学位论文HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化、鉴定及应用性研究硕士研究生

2、：刘华琴指导教师：王萍董文其摘要研究背景及目的艾滋病是目前人类面临的最严重的疾病之一。据2011年统计，全球艾滋病毒感染者仍有3400万人，其中新增感染者为250万，另有170万人死于与艾滋病有关的疾病。此外，还有680万感染者无法及时得到医治，所以艾滋病防治形势依然严峻。由于HIV本身的反复突变，对HIV疫苗的研制至今也尚未成功。因此，目前能与之抗争的最有效的手段仍以预防为主，能否对HIV感染做出快速准确的诊断是阻止其流行扩散的关键，因为对每位HIV感染者血清状况的了解有助于防止感染的再次传播。HIV编码结构蛋白的基因包括Gag、Pol、Env。gag基因产生55k

3、Da蛋白p55。p55由病毒编码的一个蛋白酶切成四个小蛋白：MA(p17基质)、CA(p24衣壳)、NC(p9核衣壳)及p6。p24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中发挥重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之间高度保守，缺失p24的病毒无法正常组装。HIV感染人体后，感染者血液中首先出现的病毒标志物为病毒p24蛋白。由于从病毒感染到检出抗HIV抗体之间存在较长的窗口期，因此，HIV-1p24抗原检测在HIV感染的早期诊断、预后判断、抗HIV药物筛选及判断母婴传播等方面具有重要意义。目前，对HIV感染的检测方法包括抗体检测、p24抗原检测

4、、核酸检测以及CD4+T淋巴细胞水平检测等。由于从感染HIV到出现可检测的抗体尚有一段摘要时间，因此虽然抗．HIV抗体检测的ELISA试剂经历了4代发展，但其“窗口期’’问题仍不可避免，而可以进一步缩短“窗口期”的核酸检测和CD4+T淋巴细胞水平检测，由于检测过程较复杂、耗时较长且需要特殊仪器而不易普及。HIV感染机体后的1～2周，血液中首先出现的病毒标志物为核心蛋白p24，病毒感染1～2个月内才能产生特异性抗体，所以仅是检测抗HIV抗体存在较长的检测窗口期。国外已经成功研制了HIV抗原和抗体联合测定的酶免试剂盒并用于HIV感染的检测。p24抗原的测定主要用于HIV感

5、染的早期检测，可缩短感染HIV病毒到检出的窗口期至12--一15d，在现有的HIV抗体测试剂中加入p24抗原的检测功能，用于献血员的检测和流行病学调查，可有效地避免窗口期的漏检，减少HIV传播的可能。HIV侵入机体后，核心抗原p24的水平随着病毒RNA水平的发展而发展，并在急性感染期即可出现，通常被认为是病毒复制的间接标志，与病情发展密切相关。因此，血液及其它体液标本中p24抗原的检测可以缩短窗口期，有助于HIV的早期诊断、预后判断及评价抗病毒治疗的效果，具有良好的实际应用价值。时间分辨荧光免疫分析(Timed—resolvedfluoroimmunoassay，TR

6、FIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术，是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体，因镧系稀土离子具有独特的荧光特性，该技术能够获得极高的信噪比，从而具有很高的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。时间分辨荧光免疫分析相对于酶免分析、放射免疫分析有更高的临床应用价值。该技术适用于各种抗原抗体的临床检测，在市场上已得到广泛应用。有必要再开发出高灵敏度的HIV抗原的时间分辨荧光免疫分析检测技术，应用于临床检测，完善产品群。方法1．p24表达工程菌的构建及鉴定利用P

7、CR技术扩增了p24基因，并进行核酸电泳鉴定大小。扩增出的目的基因片段测序并与GenBank中序列进行比对，然后将编码基因克隆到pET一28aⅡ硕士学位论文(+)原核表达质粒中，经PCR、限制性酶切分析等鉴定后转化B121(DE3)大肠杆菌，构建p24一pET28a(+)／BL21原核表达工程菌。2．重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定经IPTG诱导后，HIV一1p24基因在大肠杆菌EcoliDE3中表达His—tag融合重组蛋白。超声破菌后用亲和层析法纯化重组蛋白，透析、复性得到有活性的目的蛋白。用阳性病人血清对表达产物进行Western-blot分析和