癌睾丸抗原psp32基因克隆、表达及纯化

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1、广西医科大学硕士学位论文癌睾丸抗原Psp32基因的克隆、表达及纯化姓名：王峰申请学位级别：硕士专业：组织学与胚胎学指导教师：谢小薰20070501Psp-32SAGEC1=AM旧PX．GalPMSFTrisSDSSDS．PAGEEDTAkDMS／MS英文缩略词Precursorofspermprotein32精子蛋白一32前体SerialAnalysisofGeneExpressionCancerTestisantigenMaltose—bindingprotein基因表达系列分析技术癌睾丸肿瘤抗原麦芽糖结合蛋白5-bromo一4-chloro一3一indolyl-beta-D—galacto

2、pyranoside5．溴．4．氯．3．吲哚一13．D．半乳糖苷Isopropyl··13·-D-thiogalatopyranoside异丙基．13．D硫代半乳糖苷phenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟Trihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷Sodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳Ethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸Kilodalton干道尔顿Massspectrometry／mass

3、spectrometry串连质谱独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切责任。论文作者签名：≯磷、日期：_。7，』．蹦／保护知识产权说明本人完全了解广西医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间，博士后工作人员、人才小高地工作人员在校工作期

4、间，论文工作的知识产权单位属广西医科大学。本人保证在校期间和离校后，发表或使用论文工作成果时署名第一作者单位均为广西医科大学。学校有权保留论文，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文；、论文作者签名：‘矽绕日期：b7．‘．／6癌睾丸抗原Psp32基园的克隆、表达及纯化癌睾丸抗原Psp32基因的克隆、表达及纯化摘要’目的为了探讨Psp32抗原在临床肿瘤诊断及治疗中的价值，开发和利用该抗原，本实验克隆癌睾丸抗原Psp32基因，体外表达该基因，并对表达产物进行纯化及鉴定。方法(1)提取人睾丸组织总RNA，通过逆转录酶合成cDNA；(2)应用R

5、T-PCR扩增Psp32基因完整的开放阅读框架；(3)插入原核表达载体pMAL．C2，将构建pMAL．C2／Psp32重组质粒转化DH5Q菌，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定、内切酶鉴定和DNA测序筛出正确的pMAL．C2／Psp32重组质粒，再将其转化TBl茵进行表达；(4)用IPTG对pMAL．C2／Psp32进行诱导表达，并对IPTG浓度和加入时机以及诱导温度和诱导时间进行优化；(5)通过SDS．PAGE电泳鉴定表达的MBP—Psp32融合蛋白，并用Quantityone凝胶分析软件分析，寻找出TB】宿主菌的最佳诱导条件；(6)融合蛋白经Amylose．resin亲和层析柱纯化，并通过fact

6、orXa酶切，再次过Amylose-resin亲和层析柱得到纯化的Psp32，将纯化的Psp32蛋白进行蛋白质串联质谱分析鉴定。结果重组质粒pMAL．C2／Psp32测序与己知序列相同；成功诱导表达出融合蛋白MBP．Psp32。确定了pMAL．C2／Psp32体外表达的优化条件；37℃振荡培养3小时，加入终浓度为0．3mmol／L的IPTG，继续在30"C振荡培养5小时；蛋白质飞行质谱仪分析所得的肽段与目的蛋白相符。结论成功构建pMAL-C2／Psp32重组质粒，pMAL—C2表达载体可高效表达MBP．Psp32融合蛋白。为后续Psp32基因的研究打下基础。关键词Psp32融合蛋白克隆纯化’本

7、研究部分由国家自然科学基金(No．30360026)和广西科学基金(No．0229032)资助。2癌睾丸抗原Psp32基因的克隆、表达及纯化英文摘要Clone、expressionandpurificationofcancertestisantigenPsp32AbstractObjective：InordertoexploitandutilizethePsp32antigenandtoevalu