茶树est-ssr标记的建立及其应用研究

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1、洳；：土硕士学位论文茶树EST-SSR标记的建立及其应用研究作者姓名指导教师学科专业所在学院提交日坩盘基强糍海瑞研究员生物物理学农业与生物技术学院零零六年五月中国杭州致谢本论文是在崔海瑞研究员的精心指导和关心下完成的，导师严谨治学、诲人不倦的精神品质令学生终生难忘和钦佩。两年求学期间，崔老师对我的学习和实验给予了非常细致的指导，并在生活上提供了很大的帮助。值此论文完成之际，谨向崔老师表示深深地感谢。两年求学期间，本组夏英武教授、舒庆尧教授、张明龙副教授、吴殿星副教授、沈圣泉副教授、包劲松副教授等曾给予热心的指导和

2、帮助，在此向他们表示衷心的感谢。同时也感谢汪志平副教授、叶庆富教授、华跃进教授、徐步进教授、张永熙老师、丁捷老师等本所其他老师。同时感谢研究生同仁卢美贞、姚艳玲、忻雅、孙洁、舒小丽、赵海军、王彩霞、张琳琳、徐秀红、王桂荣、王雪艳、李小白、叶红霞、贾莉萌、孔祥礼、刘庆龙、任学良、林宝刚及本所其他同学，以及杨朝柱、许耀祖、武立权、袁名安、梁晓峰等给了我很多帮助，并伴我度过了这两年难忘的日子。感谢蒋爱兰女士、周志丹先生两年来给予的帮助!最后衷心感谢我的家人和亲戚朋友，他们多年来一直对我的学业给予不懈的支持和鼓励，在此向

3、他们表示最诚挚的谢意。金基强2006年5月于浙江大学华家池校区SSRESTgSSREST_SSREST_SNPPCRRAPDAFLPRFLPISSRSTSQTLNCBIUTRCTAB1_risEDTATEPVPPIC缩略语简单序列重复(SimpleSequenceRepeats)表达序列标签(ExpressedSequenceTags)基因组SSR(genomicSimpleSequenceRepeats)表达序列标签SSR(ExpressedSequenceTagsSSR)EST单核苷酸多态性(ESTSingl

4、eNucleotidePolymorphism)聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)扩增片段长度多态性(AmplificationFragmentLengthPolymorphism)限制片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)简单重复序列区间(Inter-SimpleSequenceRepeats)序列标签位点(SequenceTaggedSites)

5、数量性状位点(QuantitativeTraitLocus)美国国家生物技术中心(NationalCenterforBiotectmologyInformation)L、非翻译区(UntranslatedRegion)十六烷三甲基溴化铵(Cetyl—trimethylAmmoniumBromide)三羟甲氨基甲烷(啊s—hydroxymethyl-aminomethane)乙二胺四乙酸(EthyleneDiamine—TetraceticAcid)TrisEDTA聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolid

6、one)多态性信息含量(PolymorphismInformationContent)摘要利用现有生物数据库中的茶树EST资源，在了解茶树EST中SSR的信息的基础上首次建立了EST．SSR标记，同时对其在品种资源分析中的应用和相关物种中的通用性进行了探讨。主要结果如下：明确了茶树EST中SSR的频率及特性。从NCBI公共数据库下载获得1989条茶树EST，去除其中的低质量的和冗余的序列，得到全长为734．54kb的1589条无冗余EST。共在这些序列中发掘出了281个EST—SSR，分布于246条EST中，出现

7、频率是17．68％。这些EST-SSR的平均长度为33．06bD，平均分布频率是1／2．61kb。茶树EST—SSR中，二核苷酸重复是主要的重复类型，出现最多的重复基元是AG／CT重复。茶树EST中SSR信息的明确为进一步建立和应用EST—SSR标记奠定了基础。建立了茶树EST-SSR标记。本研究首先优化了茶树DNA的CTAB提取法。通过比较在提取液中添加不同浓度的Vc、PVP及0一巯基乙醇对提取效果的影响，发现添加0．1％的Vc可有效提高DNA的质量及产率。设计了16对SSR引物，在对引物、dNTP、MgCl2

8、的浓度及退火温度等参数进行测试后，建立了合适的PCR反应体系。以衍生绝大多数EST的龙井43DNA为模板，对引物进行了筛选，有13对引物显示扩增，可用率为81．3％；进一步在10个茶树品种中进行多态性测试，显现出多态性的引物占可扩增引物的53．8％。研究结果证明了根据茶树EST建立SSR标记是有效、可行的。研究了EST-SSR标记在茶树资源分析与品种鉴定中的作用。采用上述