香菇est-ssr标记的开发及应用

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1、食用菌学报@2010．17(2)：1～6文章编号：1005—9873(2010)02—0001—06香菇EST—SSR标记的开发及应用刘春滟，李南羿。，张玉琼¨(安徽农业大学生命科学院，安徽合肥230036；浙江林学院农业与食品学院，浙江临安311300)摘要：从NCBI中下载了12184条香菇(Lentinulaedodes)表达序列标签(expressedsequencetag，EST)序列，处理后得到全长3681177bp的4684个Unigene。在其中共发掘出142个简单重复序列(simplesequencer

2、epeat，SSR)，分布于120条EST中，分布频率为2．99％(平均分布距离：25．924kb)。其中，单、二、三核苷酸重复是主要的重复类型，A／T，AG／CT，ACG／CTG是单、二、三核苷酸的主要重复基序，分别占所有EST—SSR的23．23％、21．83％和10．56％。利用引物设计软件PrimerPremier5．0设计了4O对引物．并利用6％变性聚丙烯酰胺凝胶在18个香菇品种中进行检测。其中，22对引物为多态性引物，多态率为55％。应用NTSYS软件的聚类方法分析表明，18份材料遗传相似系数范围为0．375

3、~0．984，与前人研究结果相符。关键词：香菇；EST序列；SSR标记；多态性；遗传多样性简单重复序列(simplesequencerepeat，SSR)沪农一号、16．闵丰一号、17．香九、18．庆科20由随机分布在真核生物的基因组中，呈孟德尔式遗上海市农业科学院食用菌研究所尚晓冬副研究传，共显性，具有数量丰富、多态性高、重复性好等员惠赠。优点口]。公共数据库中快速增长的表达序列标签1．2香菇DNA的提取(expressedsequencetag，EST)数据为开发SSR标采用CTAB法提取香菇基因组DNA，具体记提供

4、了一个省时省力又低成本的来源[2]，EST-步骤见文献~7B。SSR还具有很高的可转移性[3，并可被用在构建遗1．3在EST数据库中发掘SSR传图谱[4及比较基因作图等方面。截止2008年8月23日，在NCBI数据库中香菇(Lentinulaedodes)具有重要的食药用价共搜索到12184条香菇EST序列，采用EST．值，其“同种异名，异种同名”的现象较普遍，需要建trimmerL8软件除去5’或3’端的polyA或立快速准确稳定的鉴定检测方法l_6]。本研究采用polyT，以及长度小于100bp的EST序列，对于18

5、个香菇品种作为模板，开发其F_ST．SSR标记，研长度大于700bp的EST，则保留其5’端的究品种间的遗传差异，可进一步应用在食用菌的菌700bp；再利用CAP3软件E9=进行片段重叠群分株鉴定和亲缘关系的分析等方面，为香菇种质资源析和聚类，拼接时设定的初始装配参数均为默认的评价和遗传育种提供参考。值，最后将得到的4684条高质量的Unigene，利用MISA_8软件在其中搜索SSR，搜索标准为：1材料和方法单、二、三、四、五、六核苷酸的最少重复次数分别1．1香菇品种为12、6、5、5、5、5次，同时也包括中间被一段序

6、18个香菇品种分别为：1．霞若香(野生)[扫列打断(不超过10bp)的不完全重复SSR。上海市农业科学院食用菌研究所陈fi』J杰研究员在统计SSR重复基序出现的类型时，将每种惠赠；2．申香2号、3．申香4号、4．L241—4、5．L基序所有的+1位移码及其互补序列均视为同一台、6．L冬香、7．L135、8．F135、9．Q135、10．个类型。如二核苷酸重复基序AG与GA、CT与Cr02、11．Cr04、12．7402、13．9015、14．98411、15．TC被归为同一个类型；单核苷酸将分为A、C两收稿日期：2009

7、—12—2l原稿；2010—03—16修改稿基金项目：上海市农业遗传育种重点实验室开放课题“香菇EST—SSR标记的开发、鉴定及其在种质资源多样性分析中的应用”(编号：shagb2009—03)的部分研究内容作者简介：刘春滟(1983一)，女，安徽农业大学在读硕士研究生，主要从事分子生物学研究。本文通讯作者E—mail：zhyuqiong．ah@126．com食用菌学报第17卷类，而二、三、四、五、六核苷酸重复基序类型的数1．6多态性统计分析量分别为4、1O、33、102和350种。统计多态性位点，有带记为l，无带记为0

8、，生1．4EST-SSR引物设计成距阵，利用NTSYS．pc2．10L1。。软件对数据进行利用引物设计软件PrimerPremier5．08]，在分析，以不加权成对算术平均法(UPGMA)对材含有SSR的Unigene中设计引物。主要设定参料进行聚类。数为：GC含量为45％～60％，退火温度为55～2结果与分析6O℃