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1、AFLP分子标记及其在茶树遗传育种中的应用研究生5班食品科学刘艳二、四、三、AFLP技术的原理和操作过程AFLP在茶树遗传育种上的应用AFLP在茶树育种上的应用前景一、AFLP分子标记技术的背景介绍AFLP背景介绍出现：AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)扩增片段长度多态性是一种选择性扩增限制性片段的方法,是一种实用的,有效的新的一种DNA分子标记技术,是由荷兰Keygene公司科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法,1993年获得欧洲专利局专利。该技术是继RFLP、SSR和RAPD之后发
2、展起来的DNA指纹技术。用途：由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。已广泛用于基因鉴定、基因作图、基因表达等方面,在茶树遗传育种研究领域也正在逐步拓展,具有较大的应用潜力。被认为是迄今为止最理想的一种DNA分子标记技术之一.AFLP背景介绍RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）是第一代分子生物学标记，主要包括以下基本步骤：DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DN
3、A片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA）即随机扩增多态性DNA标记，RAPD是建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术，其基本原理与PCR技术一致。其以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物，在热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了
4、基因组的多态性。AFLP背景介绍AFLP优点：DNA用量少、灵敏度高,不需要预先知道基因组的信息。一般一次反应可得到50～150个扩增片段,具有很高的可靠性,被认为是效率最高的标记。AFLP采用长引物和更高的退火温度进行PCR,比RAPD等其他以PCR为基础的分子标记具有更好的重复性。这种方法由于结合了RFLP和PCR的优点,既具有RFLP可靠性好、重复性高的特点,同时又具有PCR的高效性、安全性和方便性的优点。AFLP标记所检测的多态性本质上与RFLP一致,但技术上却简单的多,并且可以通过控制引物随机核苷酸的种类和数目来调节AFLP产物的条带的特异性和数量,因此能提
5、供较多的基因组多态性信息。AFLP基本原理AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增:实验中酶切片段首先与含有与其共同粘性末端的人工接头连接,连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。根据具体需要通过选择在末端上分别添加了1-3个选择性核苷酸的不同引物,这些选择性核苷酸使引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段并与之结合,实现选择性扩增。然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳,多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。AFLP技术流程图AFLP技术流程1、模板DNA的制备2、DNA扩增反应3、扩增产物的分离与检测模板DNA的制备检
6、测制备好待测DNA样品经过浓度和质量,用具有6个碱基识别位点通常是EcoRI(G/AATTC)和4个碱基识别位点的MseI(T/TAA)两种内切酶进行酶切,形成三种类型的酶切片段。DNA酶切完成后,经加热让限制性内切酶失活,酶切片段在T4连接酶的作用下与两种内切酶相应的特定接头相连接,形成带接头的特异性片段，作为扩增反应的模板。模板DNA的制备用于限制性片段切割的二种酶，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。AFLP的接头是一种人工合成的双链DNA,长度一般为14～18个核苷酸,由核心序列和内切酶位点特异序列两部分组成。由于EcoRI酶切可以产生小片段DNA便于扩增,M
7、seⅠ酶切可以产生小而稳定的酶切片段,因此,目前EcoRI接头和MseⅠ接头已广泛应用于AFLP多态性分析中。DNA扩增反应以酶切后连接产物作为模板,用人工合成的选择性单链寡核苷酸作为引物，在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。酶切片段要经过连续两次PCR扩增。预扩增采用含有一个选择性碱基或不含选择性碱基的引物进行。目的：为了减少选择性碱基的错配,为选择性扩增提供更多的模板,同时对模板起到选择性纯化的作用,避免直接扩增造成的指纹带型背景拖尾现象,从而使产生的指纹图谱更清晰和具有更好的重复性。DNA扩增反应再次扩增以预扩增产物为模板，采用含
