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1、长江大学学报(自科版)2005年2月第2卷第2期/农学卷第25卷第1期JournalofYangtzeUniversity(NatSciEdit)Feb2005Vol2No2/AgriSciV,Vol25No119AFLP标记及其在园艺植物遗传育种中的应用陈启亮(湖北省农业科学院果茶蚕桑研究所,湖北武汉430209)李清国(武汉市东西湖区园艺所,湖北武汉430040)田瑞(湖北省农业科学院果茶蚕桑研究所,湖北武汉430209)张青林(华中农业大学园艺园林学院,湖北武汉430070)[摘要]AFLP(扩
2、增片段长度多态性)标记是一种新的DNA分子标记技术,对其基本原理、方法及特点做了简要介绍。从遗传多样性和亲缘关系分析、品种鉴定和指纹图谱构建、遗传图谱构建、基因定位与克隆、QTL定位、标记辅助选择育种、基因表达与调控研究等方面概述了AFLP标记在园艺植物上的应用进展,并对其存在的问题和应用前景做了探讨。[关键词]AFLP标记;园艺植物;遗传育种[中图分类号]S6032;Q78[文献标识码]A[文章编号]16731409(2005)02001906AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)即扩增片
3、段长度多态性,是RFLP技术和PCR技术的结合。AFLP标记结合了RFLP标记的高重复性与RAPD标记不需要预先知道基因组背景,多态位点丰富等优点,克服了RFLP检测位点有限和RAPD的不稳定性等缺点,目前已经广泛应用于多[1][2][3][4][5][6]种植物的遗传育种研究,如水稻、玉米、小麦、枳、柿、花椰菜等。笔者拟对AFLP标记原理、方法特点及其在园艺植物遗传育种研究中的应用做概要介绍。1AFLP技术的原理、基本反应程序及特点11AFLP技术的发展AFLP技术是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos建立并发展起来的一种检测
4、DNA多态性的新方[7]法。该技术于1993年获得欧洲专利局专利,其专利权归属荷兰Keygene公司。Keygene公司将其商品化,于1994年推出的试剂盒上称为AFLP分析系统。这一技术很快就被人们获悉并广泛传播。因此[8]Vos等于1995年以正式论文的形式公开发表,此后每年都有很多关于AFLP标记的文章发表。12AFLP技术的基本原理AFLP技术的基本原理是选择性扩增基因组DNA的限制性酶切片段。即将基因组DNA经限制性内切酶双酶切后,形成分子大小不等的限制性酶切片段,酶切后的DNA片段连上接头形成带接头的特异片段,作为PCR扩增
5、的模板;特异性片段经PCR扩增,只有那些与引物的选择性碱基严格配对的[9]DNA片段才能被扩增出来;扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。13基本反应程序AFLP的反应程序主要包括模板DNA制备,酶切片段扩增和凝胶电泳分析等3个基本步骤。具体过程为:DNA提取和质量检测;双酶切;酶切片段首先与含有其共同粘性末端的人工接头连接,连接后的粘性末端序列和接头序列就作为以后PCR反应的引物结合位点;DNA片段的预扩增;在Taq聚合酶的作用下,完成AFLP的选择性扩增;PCR产物变性后在聚丙烯酰胺变性胶上电泳;将电泳后
6、的凝胶进行干胶处理,放射自显影后进行结果分析或将电泳后的凝胶经过银染程序进行显影。[收稿日期]20040911[基金项目]国家科技部基础性工作资助项目(00-18)[第一作者简介]陈启亮(1976),男,湖北枝江市人,湖北省农业科学院果茶蚕桑研究所助理研究员20长江大学学报(自科版)2005年2月AFLP引物由3部分组成:核心序列(coresequence,CORE);限制性内切酶识别序列(en-zyme-specific,ENZ);选择性核苷酸系列(selectiveextension,EXT)。核心系列要求与人工合成
7、的接头系列互补。选择性系列具可变性,在实际工作中,根据具体工作需要人为设立选择性核苷酸序列,其序列可由1~3个选择性核苷酸组成,以达到选择性扩增的目的。对于同一基因组DNA而言,选择性核苷酸的数目越多,选择性越强,扩增出来的产物就越少;相反,它的数目越少,选择性就差,扩增出来的产物就多。进行AFLP分析时,一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切,一种为低频剪切酶(识别位点为6碱基的rarecutter),另一种为高频剪切酶(识别位点为4碱基的fre-quentcutter)。利用双酶切可产生更好的扩增反应,在凝胶上
8、产生适宜大小并适于分离的片段,不同的内切酶组合及选择性碱基的数目和种类可灵活调整片段的数目,从而产生不同的AFLP指纹。14AFLP技术的特点AFLP结合了RFLP和RAPD
