AFLP分子标记及其应用.ppt

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1、AFLP分子标记及其应用班级：生技09-2姓名：曾和平学号：20090276AFLP基本原理AFLP特点AFLP实际应用内容简介先利用两种限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段，再使用双链人工接头的酶切片段相连接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1—3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。AFLP基本原理EcoRIMseI（限制性内切

2、酶）EcoRI接头MseI接头EcoRI引物+AMseI引物+C（预扩增）EcoRI引物+AACMseI引物+CAA（选择扩增）（连接）（电泳检测）4种分子标记比较（3）可靠性好，重复性高。（1）DNA需要量少，检测效率高，理论上可产生无限多的AFLP标记。（2）多态性高。AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目，来调节扩增的条带，具有较强的多态分辨能力。（4）对DNA模板质量要求高，对其浓度变化不敏感。AFLP结合了RFLP和RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。A

3、FLP特点构建遗传图谱分析遗传多样性基因定位分子标记辅助育种AFLP的实际应用12个地方鸡种遗传多态性的AFLP指纹分析实验背景本研究利用AFLP方法检测各个鸡种的DNA的多态性，构建12个地方鸡种的DNA指纹图谱，分析这些地方鸡种相互之间的亲缘关系，为鸡种的鉴定、资源的合理保护和开发利用提供基本资料。实验材料血样来自国家家禽品种资源基因库和其它保种区或保种场保存的地方鸡种，共计12个品种。每个鸡种取60个血液样本，血样采用70%的酒精固定、保存。流程基因组DNA提取基因组DNA的双酶切与接头连接AFLP扩增反

4、应凝胶电泳数据处理2.AFLP分析基因组DNA提取①将每个鸡种所有个体的基因组DNA等量混合，构建各个鸡种的池DNA。②用TE缓冲液将各池DNA稀释至终浓度50ng/μL,便于AFLP分析。基因组DNA的双酶切与接头连接每个取4μL基因组DNA，用PstⅠ和MseⅠ进行双酶切，酶切片段与PstⅠ和MseⅠ接头连接。AFLP扩增反应预扩增：采用不含选择性碱基(+0)的预扩增引物，每个样品反应总体积为25μL，包括模板DNA(酶切连接产物1：10稀释)2μL，Pre-ampmix1μLdNTPs1μL、10×PCR

5、buffer2.5μL、DNA聚合酶0.5μL、ddH2O18μL,反应条件为94℃30s，56℃30s，72℃80s,30个循环。72℃延伸5min。选择性扩增：预扩增产物1∶20稀释后，用于选择性扩增。选择性扩增引物5′和3′端各带有3个选择性碱基，选取6种引物组合进行选择性扩增。选择性扩增采用梯度PCR方法反应条件为：第一循环扩增参数94℃30s，65℃30s，72℃80s,以后每个循环温度递减0.7℃，扩增12个循环，经13个循环后退火温度降到55℃，再进行23个循环的扩增。凝胶电泳荧光标记的PCR扩增

6、产物用4%琼脂糖凝胶电泳检测，再向2μL的扩增产物中加2μL上样缓冲液(10%蓝色葡聚糖)，同时加1μLGENEMARK500荧光DNA梯度标准品，标准品分子量大小50~500nt,梯度为25nt。90℃变性2min，取1μL通过ABI377测序仪走4%含尿素的变性聚丙烯酰胺，从SequenceAnalysis上进行AFLP指纹图谱的分析数据处理根据各鸡种基因组DNA的AFLP标记检测结果，选取清晰可辨的多态性谱带用于数据统计分析。利用GENESCAN分析软件根据加入的荧光内标的分子量的大小，从而得到片段的大小

7、。有带的记为1，无带的记为0，建立数据库。利用SPSS软件，按公式GS=2Nxy(Nx+Ny)进行计算各品种间的遗传相似系数(geneticsimilarity,),其中Nxy代表两个品种共有的带谱数，Nx与Ny分别代表每个品种的总带谱数。各鸡种间的遗传距离(D)按公式D=1-GS计算。根据值，利用NTSYSpc分析软件按照UPGMA法进行聚类分析。展望AFLP标记技术由于集成了诸多优点,已广泛用于各种生物类型的研究,如动物、植物、微生物以及线虫等等,其主要缺点是显性标记、扩增片段偏短、不能反应标记的位置信息和

8、大规模进行单位点检测等,但随着AFLP操作平台构建和方法的完善以及生物测序进展,上述缺点都逐渐得到克服,不仅适用于对序列未知或知之较少的生物类型,而且对序列已知的生物可进行大规模表达分析和信号传导关键组分的筛选,尤其在生物多样性研究、种属特异性鉴定、表达谱分析、精细作图、基因克隆以及甲基化研究等方面具有其它标记技术无可比拟的优势。ThankYou!