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1、应用AFLP分子标记鉴定苹果品种祝军王涛赵玉军张文李光晨提要在建立苹果品种AFLP分析体系的基础上，从68对引物小筛选出了4对多态性高、分辨能力强的引物(即P32M46、P44M53、P59M41和P79M61)O分析了P32M46引物绘制的我国25个苹果重要品种的AFLP指纹图谱的遗传多样性，确定了各供试品种的差异带，区分了供试的25个苹果品种。对AFLP分析的关键步骤进行了讨论，并对生产上应用AFLP技术检测苹果品种真实性和纯度作了展望。关键词AFLP；DA指纹；苹果；品种；鉴定Identification
2、ofAppleVarietieswithAFLPMolecularMarkersZhuJun,WangTao,ZhaoYujun,ZhangWen,andLiGuangchen(CollegeofHorticulture,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094)AbstractFourpairsofprimers(i.e.P32M46,P44M53,P59M41andP79M61)withhighpolymorphismandpowerfuldistinctivcncs
3、shavebeenselectedfrom68pairsofprimerafterconstructingtheAFLPanalysissysteminapplevarieties.GeneticdiversityofP32M46AFLPfingerprintingof25importantapplevarietiesinChinawasanalyzed,differeneebandsforeachvarietiesweredetermined,andallapplevaricticstestedwereiden
4、tifiedbasedontheP32M46AFLPfingerprinting・KeypointsandapplicationfortestingtruenessandpurityofapplevarietiesofAFLPtechniqueswerediscussed.KeywordsAFLP；DNAfingerprinting；Apple(MalusdomestiesBorkh・)；Variety；Identifiertion苹果品种鉴定是种质资源研究的基础和苗木市场管理的技术手段。传统的苹果品种鉴定方法主
5、要有形态特征法、花粉显微电镜扫描法和同工酶法⑴2)。近年来，DNA分子标记技术的出现为在DNA分子水平上鉴定苹果品种提供了强有力的工貝•⑶。应用RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)分子标记技术鉴定苹果品种国内外已冇报道1，51,而应用AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)技术鉴定苹果品种的研究尚未见报道。AFLP分析的基本原理是选择性扩增基因组DNA酶切片段。曲于不同基因组DNA的酶切位点存在差异，因而产生了扩增片段长度的多态性⑹。本试
6、验丁1996-1997年在屮国农业大学“农业生物技术国家重点实验室”和中国农业科学院品种资源研究所“农业部种质资源生物技术重点实验室”进行，应用AFLP技术绘制了我国苹杲生产中25个重要品种的DNA指纹图谱，并根据该DNA指纹图谱对供试材料进行了遗传分析和鉴定。1材料与方法1.1材料供试苹果(MalusdomesticaBorkh.)品种及其亲本见表1。试材品种屮，柱型苹果品种取自屮国农业大学实验果园；其它品种取自小国农科院果树所“苹果国家种质资源圃”，其屮包括主栽品种，核心种质品种，不同生长习性、亲缘关系和突变
7、品种等儿种类型。1.2方法1.2.1模板DNA的制备于春季取健康正常幼叶放入冰壶，带冋实验室后用HC10.1mol/L溶液洗涤，无菌水冲洗。低温干燥后，按Doyle等⑺报道的CTAB(十六烷基三甲基溟化钱)法，从试材鲜叶屮提取基因组DNA。经检测后,将DNA稀释至200ng/uL,备用。1.2.2酶切每个反应总体积为25UL,其中包括：DNA250ng,PstI和Msel(BioLab)各2.5U,BSA1・2ug,0.5XRLBuffero37°C保温6ho1.2.3连接酶切后，每个DNA样品加入10uL连接混
8、合液:Pstl和Msel接头各25pmol,ATP1nmol,T.厂DNA连接酶2U,1XRLBuffer。37°C保温18h。1.2.4预扩增取5UL连接后的DNA样品，各加入15PL预扩增混合液：P00和M00各75ng,IXPCRBuffer,Taq酶0.5U,dNTP4nmolo混匀后，在PE9600PCR仪上扩增：94°C30s,56°C30s,72°C60s,
