α-1b糖蛋白前体基因的克隆及特性分析

《α-1b糖蛋白前体基因的克隆及特性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要f前言feDNA末端快速扩增(RapidAmplificationofeDNAEnds，RACE)技术是采用PCR方法，根据已知部分的eDNA序列设计引物，扩增57和3’端eDNA，是克隆全长eDNA的主要辅助手段之一。与研究整个基因组相比更加简便和快捷，可以在短时间内获得大量信息，并且可以在低丰度的转录本中进行快速扩增；与传统的文库构建筛查法相比是一种简单而有效的基因克隆方法，已经成为基因组DNA研究不可替代的一种重要手段。随着人类基因组计划的完成，人类遗传密码开始揭密，目前人类所面临的主要任务是找出编码人类蛋白质的近三万个基因在染色体上的确切位置。基于这样的目标，RA

2、CE技术作为一种基毋克隆的手段日益受到人们的重视，并对其进行了各种改良。J本研究中在本课题组进行外显子捕获的基础上，利用RACE方法，从人肝MarathoneDNA文库中克隆一个免疫球蛋白超家族的新成员：仪一1B糖蛋白前体的完整cDNA，经GenBank查新证实为一新基因，登录号为AF414429。实验材料人肝Marathon～ReadyeDNA文库基因克隆相关分子生物学试剂Northern杂交及RT—PCR相关试剂各种胎儿组织标本实验方法根据外显子捕获系统所得的外显子序列设计5’基因特异性引物及3’基因特异性引物，以RACE方法在人肝MarathoneDNA文库中进行扩增，以获

3、得对应的57和3’eDNA片段；然后进行拼接·1·得到完整的eDNA。利用生物信息学手段对该eDNA进行阅读框分析并推测其编码的蛋白质。然后进行C．enBank查新及Banklt在线登录。根据所获得的3’一RACE片段制备探针并设计引物，进行Northern杂交和RT—PCR分析，探讨该基因在人多种组织中的表达模式。实验结果5’一RACE扩增结果进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到约450bp的片段。3’一RACE扩增产物以)tHindⅢ作为分子量参照物电泳后可见约1．6kb的亮带。将5’一RACE和3’一RACE扩增产物纯化，连接到pMD一18载体上进行双向测序和引物步行测序，拼接得到

4、一条1．69kb的序列。利用NCBI提供的ORF进行开放阅读框架的判定，从第43到第1530碱基为完整的可读框，其中第1到第51碱基编码信号肽GenBank数据库查新结果证实为一新基因(GenBank登录号AF414429)，可读框全长1482个碱基序列，编码一种由495个氨基酸组成的蛋白质，在NCBI提供的TranslatedBlastSearch进行同源性比较，证实该基因编码人a—lB糖蛋白前体。Northern杂交及lit—PCR分析显示该基因在人多种组织中表达，但在胎儿肝组织中的表达占绝对优势。讨论仅一1B糖蛋白在正常成年人血清中的浓度为平均22mg／dl。它的完整氨基酸

5、序列已由Ishioka等人于1986年通过氨基酸测序而得知，但该蛋白质的核苷酸序列一直无人克隆，而且其生物学功能及在人类疾病中发挥的作用至今仍不清楚。在本研究中，我们利用RACE的方法成功地从人肝eDNA文库中鉴定出一编码人类旺一1B糖蛋白的完整eDNA，并研究了其在多种组织中的表达情况。该基因全长1694bp，其中阅读框为1482个核苷酸序列，编码·2·的蛋白质由495个氨基酸组成。人类仪一1B糖蛋白的结构域分析表明它由一个信号肽区及四个c一2型免疫球蛋白样的结构域组成，因此认为它是免疫球蛋白超家族的一个新成员。免疫球蛋白超家族的成员很多；功能也各有不同，但大都在免疫调节，细胞

6、增殖过程中发挥作用，如白细胞功能相关抗原，血小板源性生长因子受体，神经细胞粘附分子等。它们的共同之处是都具有免疫球蛋白样结构域。免疫球蛋白结构域的特殊之处在于它可以以嗜同性及嗜异性两种方式与其他结构域发生作用。因此我们推断仪一lB糖蛋白可能通过它的4个IG结构域介导不同蛋白与蛋白之间的相互作用，起一种桥连接的作用。a一1B糖蛋白的同源性分析显示没有一个已知的基因与其相似性高到足以提供进化起源方面的信息(通常相似性需达到60％以上)。最近克隆一个大鼠肝再生相关基因(基因库登录号：AF236054)，它在大鼠肝2／3切除后的0．5小时内表达增加，它编码的蛋白质有1个IG结构域，同人类

7、d一1B糖蛋白的相似性达45％，我们的Northern杂交及RT—PCR分析结果表明o【一lB糖蛋白基因多在有再生能力的组织中表达，例如肝，肠，肺，肾等，尤其在肝脏中呈现最强的表达，这与肝脏是一个具有最强再生能力的组织这一事实相附。另外还发现，该基因在胎儿肝组织中的表达明显强于正常成年人肝组织，可能由于胎儿期肝生长状态同肝切除后的肝再生有某些相似之处。基于以上的同源性比较，我们推断仪一lB糖蛋白可能是一种在细胞增殖过程中起作用的蛋白，然而这些推断在以后的工作中均有待于进一步证实。