香蕉arf3基因的克隆及功能特性分析

《香蕉arf3基因的克隆及功能特性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号．§丝墨2丝垒：笪学校代码!!!墅UDC2一一——学号么壑巨Z竺!Z一罕可芷竺笆2二Z一密级纽彦庙犬学学位论文香蕉ARF3基因的克隆及功能特性分析杨浩专业名称果树学学院名称j燮指导教师杜中军(研究员)、唐志鹏(教授)申请学位级别硕士论文提交日期论文答辩日期三!垄：当：理：学位授予日期兰：!!：』：￡：2趑兰壅答辩委员会主席堕童主论文评阅人盎：聋论文评阅八毫童lIUlIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII14110Y2408048广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成

2、果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我～同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学

3、位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。，眨怀保密。(请在以上相应方框内打“√’’)论文作者签名：搠焰。日期：2。13，j．2户-指导教师签名：勿帅酋日期如，；．d：-巧作者联系电话：J钾7皇毋弘纠电子邮箱：．均★叼叫∽@／6'厶饥广西大学硕士学位论文'I-蕉ARF3基因的克隆及功能特性分析香蕉ARF3基因的克隆及功能特性分析摘要ARF3基因属于ARF基因家族的成员，该基因比较保守，主要功能是控制细胞内物质的转运。本研究以巴西蕉为材料，分离克隆了ARF3基因cDNA全长序列，并对其生物信息学进行了分析，在此基础上构建了Carn35s—grp

4、—gus-ARF3表达载体，该载体同时含有绿色荧光蛋白和GUS报告基因，可以更准确的检测转基因植株。通过农杆菌介导的方法将ARF3基因转入烟草基因组中，并对转基因植株进行了检测，对其功能进行了分析和鉴定。得出的主要结果如下：1、香蕉RNA提取方法的优化。在前人基础上，对香蕉RNA提取方法作了改进，优化后的方法比较适用于香蕉不同器官RNA的提取，并且提取的RNA量度大、条带清晰、无污染及完整性较好，可以较好满足下游实验的需要。2、香蕉ARF3基因cDNA全长克隆及生物信息学分析。利用RACE方法首次获得了香蕉的ARF3基因cDNA全长。该基因

5、全长1427bp，编码338个氨基酸，推测蛋白质分子质量为38．24KD，等电点为5．36。开放阅读框为1166bp，其中起始密码子位于174bp，终止密码子位于1340bp。香蕉ARF3基因核苷酸序列与其它植物ARF基因核苷酸序列具有69％．74％的相似性，氨基酸序列有81％．93％的相似性。3、ARF3基因在香蕉不同器官中表达特性分析。利用半定量RT-PCR方法分析其表达特性，结果表明：香蕉ARF3基因的表达量在叶片中最高，其次是根系，茎中的表达量最低。4、香蕉组织培养体系的优化。分别采用香蕉雄花序、茎尖生长点和茎段横切薄片三种外植体材

6、料进行组织培养，经过综合比较得出的结果为：采用茎段横切薄片繁殖无菌香蕉苗具有操作简单、外植体污染率低、培育周期短等优点，可以较快繁殖出大量的香蕉组培苗，从而满足实验的需要。5、表达载体的构建及遗传转化体系的优化。利用载体Cam35s—gfp．gus上SacI和BamH1两个限制性内切酶，将目的基因插入到多克隆位点区，从而完成载体的构建。在遗传转化体系优化过程中，筛选出卡那霉素的致死浓度为400mg／L，半致死浓度为200mg／L；抗性培养基中羧苄青霉素的浓度为500mg／L时可以很好地抑制农杆菌的生香蕉ARF3基因的克隆及功能特性分析长；农

7、杆菌侵染时间在15min，菌液浓度0D600值为0．8时转化效率最高。6、转基因植株的检测及功能分析。提取烟草的DNA和RNA，利用特异性引物扩增对阳性植株进行检测；利用GUS报告基因对香蕉ARF3基因在烟草中的瞬时表达进行检测；利用绿色荧光蛋白报告基因对阳性植株进行检测。结果表明：阳性转化率达到近80％；染色反应过程中，烟草的叶片出现蓝色斑块；利用荧光显微镜可以明显地看到烟草局部叶肉细胞有较强绿色荧光发出。转基因的烟草与对照相比，呈现生长速度快、植株高大、叶色浓绿、叶面积显著增加的特点。关键词：香蕉；cDNA克隆；ARF3基因；遗传转化；

8、基因功能；表达载体II广西大掌硕士掣H立论文香蕉ARF3基因的克隆及功能特性分析TheCloningandAnalysisofARF3GenefromBananaandFunct