凝集素基因克隆及功能分析

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1、中国农业科学院硕士学位论文凝集素基因克隆及功能分析姓名：苗猛猛申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王志兴201106摘要目前农业生产中，蚜虫危害十分严重，造成巨大的经济损失。转基因技术的发展为植物抗蚜品种的培育开辟了新的途径。已有研究表明，植物凝集素作为一种非免疫球蛋白，是一种潜在的抗蚜候选蛋白。因此，本研究拟以抗蚜虫的三叶半夏、掌叶半夏及海芋为材料进行凝集素基因的克隆，并导入到模式植物烟草中进行抗蚜能力分析，以期为植物抗蚜基因工程的研究提供新的基因源。主要研究结果如下：1、根据已获得的天南星科凝集素基因保守区序列设计简并引物，利用同源克隆技术以提取的三叶

2、半夏RNA反转录得到的cDNA为模板，通过Ⅸ’R扩增获得了约400bp的基因片段，然后通过3’和5’RACE技术克隆得到了该基因的全长cDNA序列，序列分析表明：该基因cDNA全长为1173bp，开放读码框为810bp，编码269个氨基酸的前体蛋白；编码蛋白包含3个QDNY结构域，即甘露糖结合位点，推测其可能为凝集素基因；然后与已公布的凝集素进行同源性分析，发现该基因编码蛋白与其他天南星科凝集素基因编码蛋白相似性介于76％一91％，进一步说明了该基因可能为单子叶甘露糖凝集素基因，命名为PtLec。2、按照相似方法，从海芋中获得了一个基因的全长cDNA序列，序列分析表明：该基

3、因cDNA全长为1093bp，开放读码框为813bp，编码270个氨基酸的前体蛋白；编码蛋白包含2个QDNY结构域，即甘露糖结合位点，猜测其可能为凝集素基因；然后将其与已公布的凝集素序列进行同源性分析，发现该基因的编码蛋白与其他天南星科凝集素基因的编码蛋白的相似性介于75％一86％，进一步说明了该基因可能为单子叶甘露糖结合凝集素基因，命名为AmLec。3、我们通过同样技术从掌叶半夏中克隆得到了一个基因的全长cDNA序列，序列分析表明：该基因cDNA全长为1112bp，开放读码框为810bp，编码269个氨基酸的前体蛋白；该基因编码的蛋白包含2个QDNY结构域，即甘露糖结合位

4、点，猜测其可能为凝集素基因：通过与已公布的凝集素序列进行同源性分析，发现该基因的编码蛋白与其他天南星科凝集素基因的编码蛋白的相似性介于75％一84％，进一步说明了该基因可能为单子叶甘露糖凝集素基因，命名为PpLec一4、将获得的三个凝集素基因分别构建了RbcSl和35S启动子驱动的植物表达载体，并通过农杆菌介导法转化烟草，获得了由RbcSl和35S启动子驱动的PtLec，她基因的转基因烟草植株。5、由35S启动子驱动的PtLec转基因烟草已进行抗蚜检测，分子检测也证明目的基因已整合到烟草基因组中。抗蚜结果显示转基因烟草不同程度的抑制了虫口密度，抑制程度最高达48．4％。其他

5、转基因烟草的抗蚜能力检测正在进行中。6、我们还将获得的凝集素基因分别构建了原核表达载体，在大肠杆菌中成功的表达出了海芋凝集素融合蛋白，并通过镍柱亲和层析对融合蛋白进行了纯化，为以后抗体的制备奠定了基础。其余两个基因的表达纯化正在进行之中。关键词：蚜虫，三叶半夏，掌叶半夏，海芋，RACEAbstractAphidsaresapsuckinginsectpestscausingseriouseconomiclosses．Itisreportedthatlectin，knownasnon—immunoglobulin，hadshowedagoodcadidateproteinfo

6、raphidsresistance．Inordertoclonemoreeffectivegenesforanti—aphid，lectingenesfromPincliaternate、Alocasiamacrorhiza、Pinelliapedatisecta，wereclonedandtransformedintotobacco(akindofmodelplants)throughAgrobacterium-mediatedtransformation．Theresistanceabilityoftransgenictabaccotoaphidshadbeeninve

7、stigated．Themainresultswereasfollow：I、AccordingtotheconservedregionsofavailableAraceaeleefrogenesequences，degenerateprimersweredesigned，andsequenceabout400bpwasobtainedthrouthRT-PCTusingRNAextractedfromPinelliatematetuber．Thefull—lengtheDNAofPincliaternatewaso