白纹伊蚊RH类糖蛋白基因的克隆与生物学特性研究

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1、中山大学博士学位论文白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因的克隆与生物学特性研究姓名：吴瑜申请学位级别：博士专业：病原生物学指导教师：詹希美20080529白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因的克隆与生物学特性研究中山大学博士学位论文蚊体内的铵离子通道的同类物还知之甚少。我们对GenBank中各种蚊虫的核酸序列扫描结果显示：冈比亚按蚊、致倦库蚊和埃及伊蚊均存在Rh类糖蛋白，其氨基酸序列与鼠Rhbg、人RhBG、果蝇Rh50类糖蛋白的一致性为45．77％。生物信息学分析提示：蚊Rh类糖蛋白可能是重要的铵离子通道超家族成员。目前，Rh类糖蛋白在蚊体

2、内的分布、作用及功能位点尚无所知，对这些内容进行全面研究将有助于新型杀虫剂作用靶标的发现。因此，本课题以登革热的重要媒介白纹伊蚊为研究对象，克隆其Rh类糖蛋白(AedesalbopictusRhesus-likeglycoprotein，AaRh)基因的全长eDNA，确定该蛋白的组织分布和作用特性，鉴定蚊类铵离子通道超家族成员。研究方法1．AaRh全长cDNA序列的获得及其生物信息学分析1．1应用简并引物RT-PCR获取白纹伊蚊Rh类糖蛋白的基因片段根据冈比亚按蚊、埃及伊蚊等亲缘关系较近物种的Rh类糖蛋白同源性分析结果

3、，我们分别在184／343和219／339氨基酸位点设计2对简并引物，以白纹伊蚊雌蚊总RNA为模板，合成eDNA第一链，应用巢式PCR扩增AaRh的基因片段。1．2应用RACE方法获取AaRh基因的全长eDNA序列根据获得的AaRh基因部分序列，设计2对特异性引物daRhGSPI、GSP2和AaRhGSP3、GSP4，应用5’RACE和3’RACE分别扩增AaRh基因的5’端和3’端eDNA片段，然后拼接出全长eDNA序列。1．3AaRh核苷酸序列及推测的氨基酸序列生物信息学分析通过NCBI网站的BLASTx程序(ht

4、tp：／／www．ncbi．nim．nih．gov／BLAST／)，将目的基因序列与GenBank中的相关序列进行比对，判断该基因是否是全长基因，并推导氨基酸序列。通过蛋白分析专家系统Expasy(http：／www．expasy．org／)所提供的蛋白质序列分析工具：ProtParam程序预测蛋白质的理化性质，包括分子量、等电点、氨基酸组成、在溶液中的稳定性等；PROSITEmotif程序预测一级结构中糖基化、脂酰化、磷酸化等修饰位点和模序；SignaiP程序分析分泌信号肽特征序列；InterProScan程序扫描一

5、级结构中包含的结构和功能域特征序列；SOSUI．II—白纹伊蚊Rh类糖蛋白基冈的克隆与生物学特性研究中山大学博士学位论文程序预测AaRh蛋白的跨膜区、拓扑结构等二级结构。通过在线生物信息学软件EMBOSS(htto：／／bioweb．pasteur．fr／seqanal／EMBOSS)预测线性抗原决定簇和氨基酸的亲水性。利用CLUSTALW程序对白纹伊蚊AaRh与GenBank中其它物种的同源蛋白序列进行比对分析，构建分子进化树。2．AaRh的组织定位和血餐诱导表达分析2．1构建pEGFP-AaRh真核表达质粒，转染H

6、ela细胞根据AaRhmRNAORF序列，分别在起始密码子后(包括起始密码子)和终止密码子前(不包括终止密码子)设计一对特异性引物，扩增AaRh全长eDNA。通过双酶切真核荧光表达载体pEGFP．NI和AaRh全长eDNA、连接等分子克隆步骤，构建pEGFP-AaRh重组质粒。将pEGFP-AaRh和pEGFP-N1分别转染Hela细胞，24h、48h、72h后在荧光显微镜下观察、照像。2．2白纹伊蚊C6／36细胞内AaRhmRNA的鉴定根据AaRhmRNA全长序列设计茎环结构的分子信标探针，转染白纹伊蚊C6／36细胞

7、，4h后行荧光显微镜观察、照像。2．3AaRh蛋白在白纹伊蚊雌蚊的免疫组织定位根据AaRh氨基酸序列抗原表位预测结果，选取两个可能的抗原表位363．376aa和433-446aa，人工合成两段多肽，分别与载体KLH偶联后免疫家兔制备抗血清。制备白纹伊蚊雌蚊的石蜡切片，通过免疫组化方法确定AaRh蛋白的组织分布。2．4AaRh基因在蚊各发育阶段及血餐前后的时空表达模式以SYBRGreen为荧光染料，AaRhGSPl、GSP2为特异性引物，应用荧光定量RT-PCR确定AaRh基因在蚊虫不同发育阶段(卵、幼虫、蛹)的表达水平

8、；雌蚊不同组织(头、胸、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢)在血餐前后不同时间点的AaRh转录水平。研究结果1．AaRh基因全长cDNA序列的获得及其生物信息学分析应用2对简并引物进行巢式PCR，获得379bpAaRh基因片段。应用5'RACE．．III．．白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因的克隆与生物学特性研究中山大学博士学位论文和3'RACE方