白纹伊蚊嗅觉结合蛋白克隆、鉴定和功能分析

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3、UlIIIUllIIIIIIIY2406452博士学位论文一白纹伊蚊嗅觉结合蛋白的克隆、鉴定和功能分析博士研究生：邓裕华指导教师：陈晓光教授摘要研究背景：蚊是一类重要的医学昆虫，不仅叮咬骚扰人类，同时还可能传播多种疾病，如疟疾、丝虫病、登革热、流行性乙型脑炎、黄热病等，对人类的健康产生极大的危害。蚊媒病流行范围广，传播力强，发病率高，全球每年有上亿人感染疟疾、登革热等蚊媒病，死亡人数过百万。据统计，在世界范围内，每年有成百上千万人感染疟疾，每年有多达一百万的儿童死于疟疾，疟疾的流行给人类造成了巨大灾难并带来难以承受的

4、经济负担IlJ。在我国每年也因为蚊子的叮咬而发生多种疾病，蚊媒传染病仍然是威胁人们健康的主要因素之一【2’引。媒介蚊虫防制是控制蚊媒传染病流行的重要措施。目前，对于登革热、黄热病、西尼罗病毒病等蚊媒病毒传染病尚无特效治疗方法或特异性预防手段，而疟原虫对传统药物抗药性也逐渐凸显，媒介控制在预防其发生和流行方面的重要性就显得更加突出，而寻求有效的控制方法则成为世界医学界面临的重要课题。虽然媒介化学防制由于其突出的效果在蚊媒防制中一直占有统治地位，但是化学农药所造成严重的环境污染，易引起蚊虫药物抗性的产生等弊端日益显现，因此，

5、控制蚊虫的种群数量和密度，从而减少蚊媒传染病的发生率和死亡率则显得意义重大。蚊虫对周围环境的识别，主要依赖于自身的感官系统，如嗅觉系统、味觉系统等。对嗅觉系统的深入研究，有利于我们了解蚊虫的生活习性，同时也有利于我们探讨各种不同的化合物对蚊虫的趋避活性。摘要白纹伊蚊要进行生存与繁殖，其行为在很大程度上依赖于嗅觉系统。近年来，国际上在蚊嗅觉结合蛋白领域取得了一些突破性的进展，如在致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)中已经

6、发现的经典OBPs(classicOBPs)分别有33，34和55个H～1。尽管如此，由于白纹伊蚊的基因组序列还未公布，限制了对该种蚊属的全方位研究，尤其对白纹伊蚊嗅觉系统的研究，包括对嗅觉结合蛋白和嗅觉受体的了解都知之甚少。研究目的：本课题研究拟初步探讨白纹伊蚊嗅觉系统的主要组成成分之一一嗅觉结合蛋白(OBP)，通过实验室研究分析其分子结构特征，掌握其时空特异性表达谱，探讨其在白纹伊蚊嗅觉发生过程中的重要作用，阐明嗅觉结合蛋白对气味分子的识别作用及其调控的分子机制，从而为新型的、环保的、高效的蚊引诱剂或驱避剂的筛选奠定

7、科学的理论基础。研究方法：1．对部分白纹伊蚊基因组DNA序列进行测序分析(此部分由陈晓光教授等完成)；2．利用tBLASTn的方法，以埃及伊蚊OBPs的氨基酸序列作为索引，对白纹伊蚊基因组DNA序列进行同源比对比对分析；3．通过RACE法，利用巢式PCR(nestPCR)扩增白纹伊蚊OBP的全长eDNA序列(包括其N端的非编码序列(untranslatedregion，UTR)与C末端的PolyA终止序列)；4．对所获得的白纹伊蚊OBPs进行一系列的分子生物信息学分析，如预测OBPs的分子量、等电点(isoelectri

8、cpoints，IP)和N端的信号肽(signalpeptides，SP)及其长度；5．利用网络数据库分析OBP蛋白的保守结构域(conserveddomainsdatabase，CDD)及进行氨基酸序列比对，分析它们的分子结构特征；博士学位论文6．利用软件MEGA4．0对白纹伊蚊OBP进行系统进化树分析，分析它们与及埃及伊蚊、冈比亚按蚊、致倦库蚊OBP的亲缘关系；7．通过RT-PCR，分析白纹伊蚊OBP的组织特异性表达谱(触角、喙、下颚须、足和躯干)，同时还分析了AalbOBP37和AalbOBP39的时间表达谱和性别

9、特异性表达谱；8．构建原核表达载体pET-22(b)一OBP37和pET-22(b)-OBP39，并进行PCR鉴定和测序分析；9．靶标蛋白AalbOBP37和AalbOBP39的诱导表达、纯化，并通过SDS．PAGE和westernblot鉴定；10．通过软件SwissPdbViewerprogramme‘'Deep-View'’分析靶标蛋白OBP37和OBP39的3D空间结构；11．蛋白．荧光配体结合分析实验(Fluorescentbindingassay)分析靶标蛋白OBP37和OBP39与不同气味分子的亲和力，同时

10、还分析靶标蛋白OBP37和OBP39在不同pH环境中与配体吲哚(indole)的亲和能力；12．通过胸腔注射靶标基因OBP37和OBP39的dsRNA，进行RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，并通过荧光定量PCR检测RNAi的效果；13．触角电位(Electroantennogram，EAG)分析