白纹伊蚊嗅觉受体or7的基因克隆、鉴定和初步功能分析

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文白纹伊蚊嗅觉受体OR7的基因克隆、鉴定和初步功能分析—^1’‘■-·‘1●●●^·一Llonin2，CnaracterizatiOnandDrellmlnarVfunctionalanalysisofodorantreceptor7inAedesalbopictus课题来源：国家自然科学基金(81371845)学位申请人周宁导师姓名陈晓光专业名称病原生物学培养类型学术型培养层次硕士研究生所在学院公共卫生与热带医学学院2014年03月21日广州硕士学位论文白纹伊蚊嗅觉

2、受体OR7的基因克隆、鉴定和初步功能分析硕士研究生：周宁指导教师：陈晓光教授摘要研究背景：蚊是一类重要的媒介昆虫，它不仅叮咬人类，而且能够传染多种疾病，如登革热、疟疾、丝虫病、黄热病，流行性乙型脑炎等，对人类的健康产生很大危害。蚊子的吸血，交配，产卵等主要依赖于其嗅觉系统。蚊的嗅觉系统主要包括嗅觉结合蛋白(odorant—bindingproteins，OBPs)、嗅觉受体(odorantreceptors，ORs)以及嗅觉受体神经元(olfactoryreceptorneurons，ORNs)，其

3、主要分布在触角、上颌须以及喙，其内部含有多种形态各异的嗅觉感应器(简称嗅器)。在整个嗅觉发生过程中，嗅觉结合蛋白和嗅觉受体起着关键作用。因此，蚊嗅觉受体功能的研究，对蚊媒传染病的防控具有重要意义。目前研究表明冈比亚按蚊含有79个嗅觉受体基因，埃及伊蚊含有131个嗅觉受体基因，淡色库蚊含有180个嗅觉受体基因。对白纹伊蚊嗅觉受体基因fAe．Albopictusolfactoryreceptor)的研究较晚，国内对于白纹伊蚊嗅觉受体基因的研究至今仍是一片空白。直到2012年5月，世界上才有第一个白纹伊蚊

4、嗅觉受体基因的研究报道，即白纹伊蚊嗅觉受体基因2(AalOr2)，其编码区有6个外显子被5个内含子分离，cDNA全长1556bp，最终的蛋白产物含376个氨基酸，且有7个跨膜区。l中文摘要蚊Orco基因是蚊嗅觉受体基因家族的一部分，它能够和嗅觉受体基因共同作用，识别气味分子。果蝇，冈比亚按蚊，淡色库蚊，埃及伊蚊的Orco基因分别是其嗅觉受体基因Or83b，AgOr7，CqOr7，AaeOr7。当外界气味分子进入蚊嗅觉系统时，气味分子首先和嗅觉结合蛋白(OBP)结合，OBP将气味分子运送至嗅觉受体(O

5、R)，由于嗅觉受体基因表达在嗅觉受体神经元(oRN)细胞膜上，所以气味分子的刺激可以改变ORN细胞膜离子通道的开放或者关闭，进而影响细胞膜内外电压的变化。嗅觉受体神经元细胞膜电位的改变信号传送到蚊中枢神经系统，进而引起蚊行为的变化，对气味分子是趋避或者被引诱。至于Orco基因是否可以增强嗅觉受体基因对气味的识别能力，‘有待于进一步研究证明，现有研究表明Orco基因和Or基因共同作用对于气味的识别能力具有选择性。在对部分气味分子的识别过程中，Orco基因确实可以增强0r基因对于气味的识别能力，但是对于

6、另一部分气味的识别能力，Orco基因对Or的增强作用不是很理想。避蚊胺(DEET)是常用的蚊媒趋避剂，已广泛使用近六十年，它可以扰乱蚊子对于人汗液气味分子的识别功能，起到趋避的效果。吲哚类气味分子是一种重要的蚊媒引诱剂，吲哚在人体汗液气味分子占近30％。在用近30种气味分子刺激白纹伊蚊嗅觉受体基因Or2和黑腹果蝇Orco基因共表达的人类胚胎肾细胞(HEK293)时，其胞内钙离子的浓度在吲哚刺激下达到最高，这证实了白纹伊蚊嗅觉系统对吲哚的反应很强烈，当然，在幼虫行为实验中，也证实了吲哚对于白纹伊蚊幼虫

7、的吸引作用。基于此，本研究用避蚊胺(DEET)和1．甲基3．吲哚两种气味分子刺激白纹伊蚊嗅觉受体基因Or7单独表达和其与冈比亚按蚊Orco基因共表达的HEK293细胞，研究表明：在气味分子1．甲基一3．吲哚刺激下，胞内钙离子的浓度逐步上升至峰值；相反，在避蚊胺硕士学位论文(DEET)刺激下，其胞内钙离子浓度不断下降至基线值以下。蚊嗅觉基因对于气味分子浓度变化的识别是蚊媒嗅觉系统研究的一个热点。在用五种相同浓度10。气味分子刺激埃及伊蚊嗅觉受体基因AaeOr2和AaeOr7共表达的爪蟾卵母细胞时，发现

8、，细胞对于避蚊胺(DEET)的反应最为强烈。同样的结果也出现在埃及伊蚊嗅觉受体基因AaeOr8和AaeOr7共表达的爪蟾卵母细胞中。有趣的是，当用气味分子吲哚浓度为10’7M刺激两组共表达的爪蟾卵母细胞时，细胞对该浓度下吲哚的反应极其强烈，远高于细胞在避蚊胺(DEET)为10。M浓度刺激下的反应强度。尽管如此，当DEET浓度在10。oM增加到10’5M的过程中，细胞对DEET的反应也逐步增强，并在10‘5M浓度时候达到峰值，同样的变化趋势也发生在吲哚的刺激下。更加有趣