白纹伊蚊coi基因多态性分析及ago2和dcr-2基因克隆、转录水平的初步研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文白纹伊蚊COI基因多态性分析及AG02和Dcr-2基因克隆、转录水平的初步研究C01GenePolymorphismAnalysisofAedesalbopictusandPreliminaryStudyonCloning、TranscriptionLevelofAG02andDc卜2Genes课题来源：国家自然科学基金(No．30872198，30972566)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员病原生物学蔡燕丽郑学礼教授王殉章教授伦照荣教授陈晓光教授朱家勇教授陆家海

2、教授论文评阅人陈晓光教授张玲敏教授2012年5月22日广州硕士学位论文白纹伊蚊COI基因多态性分析及AG02和Dcr-2基因克隆、转录水平的初步研究硕士研究生：蔡燕丽指导教师：郑学礼教授摘要蚊虫(Mosquito)是自然界中一类最常见的昆虫，在分类上隶属于昆虫纲(ClassInsectaLinnaeus)，双翅目(Diptera)，蚊科(Culicidae)，是多种重要疾病的传播媒介。蚊分为三个亚科(subfamilies)：巨蚊亚科(Toxorhyncitinae)、按蚊亚科(Anophelinae)和库蚊亚科(Cul

3、icinae)，其中按蚊亚科和库蚊亚科的许多蚊虫能传播病原体，是医学上重要媒介昆虫或称为病媒昆虫。蚊虫不仅吸血滋扰人类，影响人们的正常工作与休息，还传播多种蚊媒病，直接威胁人类的健康与生命，在世界上大部分地区已成为严重的公共卫生问题。以蚊虫作为传播媒介的病原体要顺利从一个动物宿主传播至另一动物宿主，必须在蚊体内建立有效的繁殖传播模式并同时避免杀死传播媒介。蚊虫传播病原体的能力受到其遗传因素的控制。在长期的进化过程中蚊虫不断受到环境的选择压力，导致种群间基因交流、种群遗传结构出现变化，产生遗传多样性，出现一个种群内也可存在

4、两种以上不同遗传类型的个体。了解它们的差异与传播疾病的能力之间的关系，对蚊媒病的防控具有重要的意义。利用多种分子生物学技术对蚊虫的种群进行遗传分析，调查不同地区蚊虫种群遗传结构和基因流程度，对于控制虫媒传染病具有重要的价值。Kamgang等对非洲喀麦隆南部12个采样地的白纹伊蚊6个微卫星位点和2个线粒体基因ND5和COl遗传多样性进行分析，发现喀麦隆白纹伊蚊种群低水平的遗传变异中文摘要与近年该物种多次入侵及扩散到该国的现象相关联，其自然种群的遗传结构指向白纹伊蚊由热带地区引入。线粒体DNA在昆虫等生物体内广泛存在，可作为

5、遗传差异分析和特定病毒传播媒介识别的有效标记。蚊虫对病原体的感染能力固然受到自身遗传因素的影响，蚊虫感染病原生物的过程中，实际上也是病原生物侵袭与蚊自身防御的相互斗争过程。RNA干扰作为蚊虫自然抗病毒免疫效应，在生物抗病毒感染、生物发育时序的控制、细胞生长和凋亡等过程中发挥着重要的作用。由siRNA介导的RNA干扰抗病毒效应已在多种媒介昆虫中发现，其中AG02和Dcr-2基因起着关键作用，通过控制或改造媒介RNAi抗病毒效应成为分析媒介和病毒间相互作用的常用手段。如Vargas等通过RNAi沉默AG02、Dcr02和R2

6、D2基因的表达后，能增加登革2型病毒(Denguevirustype2，DENV2)在埃及伊蚊体内的复制同时缩短病毒传播的外潜伏期。本文尝试对广州市白纹伊蚊COl基因遗传多态性进行分析，从分子水平上探索其与登革热流行的关系；并尝试对白纹伊蚊RNAi通路中重要的两个关键基因AG02和Dcr-2用简并引物进行体外克隆，初步分析它们在白纹伊蚊不同发育阶段和感染登革前后的转录水平，以了解RNAi在白纹伊蚊抗病毒效应中的作用机制，对评估白纹伊蚊的媒介易感效应有着重要的参考价值。目的：1．分析广州市内不同群体白纹伊蚊细胞色素C氧化酶

7、亚基I基因遗传多态性。2．克隆白纹伊蚊AG02和Dcr-2基因片段并进行生物信息学分析。3．分析各发育阶段白纹伊蚊AG02和Dcr02基因的转录水平。4．白纹伊蚊雌蚊经胸腔注射感染登革2型病毒，分析感染前后AG02和Dcr．2基因的转录水平差异。方法：1．2010年9月采集并鉴定广州市12个点的白纹伊蚊成蚊和幼虫。Ⅱ硕士学位论文2．单蚊提取白纹伊蚊雌蚊基因组，扩增细胞色素C氧化酶亚基I基因并纯化PCR产物。3．所有样本COl基因PCR产物经Taqi酶切成小片段，用单链构象多态性方法筛选电泳条带有差异的样本。4．筛选的样品

8、连接pMDl8．T载体、克隆测序，获得序列样本进行变异位点分析，并构建COl基因系统进化树。5．利用CODEHOP方法设计AG02和Dcr-2基因的简并引物，以白纹伊蚊雌蚊cDNA为模板克隆目的基因片段，并对测序结果进行生物信息学分析。6．设计扩增AG02和Dcr-2基因特异性引物，分析不同发育阶段白纹伊蚊AG02和