白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白(alalp)的重组表达和功能研究

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1、万方数据温州医科大学硕士学位论文万方数据温州医科大学硕士学位论文目录英文缩略词．．⋯．．．⋯．．．．．．．．．⋯⋯．．⋯⋯j．⋯⋯⋯．．3中文摘要．．．．⋯．．⋯⋯⋯．．．．⋯⋯．．．．．⋯．．．．．．．⋯⋯4Abstract．．．⋯⋯⋯．．⋯．．⋯⋯．．．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．7前言．．．．．．．．⋯．．⋯．．⋯．⋯．⋯．．．．．．．．⋯．⋯．．．⋯．．10技术路线．⋯⋯．．⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11第一部分生物信息学分析．⋯．．．．⋯⋯．．．⋯⋯．．．．．．．．．121．材料与方

2、法．．⋯⋯．．⋯⋯．⋯⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．．122．结果．．．⋯．．⋯．．．．．⋯．．．．．⋯⋯．．⋯．⋯⋯⋯．．133．分析与讨论⋯．．⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯．．．．．⋯⋯．174．小结．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．⋯．．．⋯．．⋯⋯⋯．．．．．．18第二部分aIALP全长cDNA的扩增和TA克隆．．．⋯⋯⋯⋯191．材料与方法⋯．．．⋯⋯．⋯．．．．．⋯．⋯．⋯．．．．．．．．．192．结果⋯．．．⋯．．．．．．．．．．⋯⋯．．⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯223．分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．

3、⋯．⋯．⋯．．274．小结⋯⋯．．⋯⋯⋯．．．．．．．⋯．⋯．．⋯．．⋯⋯．．．27第三部分aIALP成熟肽基因的原核表达和抗原性分析⋯⋯．．281．材料与方法⋯⋯．⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯．．．282．结果⋯．⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．⋯333．分析与讨论．．．．．．⋯．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．．⋯⋯．．⋯364．小结．⋯⋯⋯．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．⋯．⋯⋯．．37第四部分aIALP成熟肽基因的真核表达和抗凝血活性分析

4、⋯．381．材料与方法．．．．．．．．．⋯⋯．．⋯．．．．．．．．⋯．．⋯．．．．．382．结果．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯．．⋯．．．⋯．．⋯．．．．．443．分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．474．一】、结⋯．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．⋯．．⋯．．48结语与讨论．．．．⋯⋯．．．．．⋯．．⋯．．⋯．．．．．⋯⋯．．⋯．．49参考文献．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．50万方数据温州医科大学硕

5、士学位论文附录．．．．．．．⋯．．．．．⋯．．⋯．．．．．⋯．⋯⋯．．．．．．．．．．．54致谢．．．．．．．．⋯．．．．．．⋯．⋯．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．55综述⋯⋯．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．．．．．．．．⋯．．．56学位论文独创性声明．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯．．⋯⋯672万方数据温州医科大学硕士学位论文万方数据温州医科大学硕士学位论文白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白(alALP)的重组表达和功能研究中文摘要蚊能传播多种疾病，严重危害人类健康。蚊唾液腺中存在多种功能蛋

6、白，如抗凝剂、抗炎剂和免疫流行病学分子靶标等。虽然，已有报道蚊唾液腺30KD的蛋白组分是主要的分泌蛋白，具有很强的抗原性，但是其单个成员的蛋白抗原性及是否具有其它生物学活性尚不清楚。最近报道了其成员之一的埃及伊蚊(Aedesaegypti)aegyptin蛋白具有抗凝血活性，能特异性阻断血小板和胶原蛋白的结合。本文通过生物信息学分析发现，白纹伊蚊(aedesalbopictus)30KD蛋白家族的一个成员与aegyptin蛋白高度同源，命名为白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白(爿．albopictu

7、saegyptin-likeprotein，alALP)，并构建表达载体，制备了重组alALP，初步分析了其抗原性及抗凝血活性。目的构建alALP的原核表达系统和真核表达系统，制备重组alALP融合蛋白，分析其抗原性和抗凝血活性，探讨alALP作为暴露蚊叮咬免疫流行病学分子靶标和抗凝血活性药物的可行性。方法1．生物信息学分析。运用生物信息学方法分析蚊唾液腺30KD蛋白家族的系统发育树，分析alALP与aegyptin蛋白的同源性、二级结构、亲水性和抗原肽段，分析a眦P蛋白的信号肽和成熟肽。2．alALP

8、基因的克隆。提取白纹伊蚊唾液腺总RNA，根据aLALP的基因编码序列(Oenbank：AAV90693．1)设计引物，RT-PCR扩增alALP的成熟肽基因，亚克隆至pMDl9．T载体，测序验证。3．alALP的原核表达和抗原性分析。扩增alALP的成熟肽基因，克隆到E．ColiBL21原核表达载体(pGEX-6P．1)，经IPTG诱导表达。利用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)分析